本文關(guān)鍵詞：農(nóng)桿菌介導(dǎo)的GmWRKY70基因轉(zhuǎn)化大豆的研究

  更多相關(guān)文章： 大豆 GmWRKY70 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法 T-DNA整合位點(diǎn)

【摘要】：大豆是重要的經(jīng)濟(jì)和油料作物,也是植物蛋白、脂類、礦物質(zhì)和維生素等物質(zhì)的天然資源,可供糧用、油用和飼用。近年來(lái),國(guó)內(nèi)糧食作物田間收益不斷增加,使得農(nóng)田收益較小的大豆種植面積進(jìn)一步萎縮,國(guó)內(nèi)大豆的供需均衡在一定程度上依賴國(guó)際市場(chǎng),使我國(guó)面臨嚴(yán)重的產(chǎn)業(yè)危機(jī)。大豆在生長(zhǎng)過(guò)程中很容易受到逆境脅迫的影響,遭遇脅迫時(shí)產(chǎn)量往往會(huì)大幅度銳減乃至絕收,因此許多科研工作者運(yùn)用傳統(tǒng)育種方法和轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育新品種來(lái)增加大豆單產(chǎn)水平,同時(shí)運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗逆新品種使之適應(yīng)不同生長(zhǎng)環(huán)境(如鹽堿、低溫、凍害、干旱等),就可在保障主糧栽培區(qū)域不減少的情況下擴(kuò)大大豆栽培。這對(duì)增加農(nóng)民田間收益和國(guó)內(nèi)大豆產(chǎn)量、以及確保國(guó)家食品戰(zhàn)略安全等都意義重大。以5種不同基因型大豆為試驗(yàn)材料,初步探索出耐鹽大豆的簡(jiǎn)易鑒定方法：在大豆植株長(zhǎng)至兩葉一心期時(shí),分別進(jìn)行0、150 mmol/L鹽濃度處理,7d后進(jìn)行農(nóng)藝性狀觀察,其植株株高、植株地上部分生物量的相對(duì)差異以及鹽處理10d后的植株萎蔫率均可作為篩選耐鹽大豆的主要參考指標(biāo)。以大豆品種‘東農(nóng)50'為受體材料,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化法,將耐逆相關(guān)GmWRKY70基因?qū)氲酱蠖够蚪M中,以期望獲得可以穩(wěn)定遺傳的抗旱耐鹽大豆新種質(zhì)。同時(shí),對(duì)轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)基因種質(zhì),運(yùn)用反向PCR技術(shù)進(jìn)行T-DNA整合位點(diǎn)分析。主要結(jié)果如下：1、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的GmWRKY70基因的遺傳轉(zhuǎn)化。以大豆品種‘東農(nóng)50'的子葉節(jié)為受體材料,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的子葉節(jié)法對(duì)植物表達(dá)載體pFGC5941-GmWRKY70進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)基因株系L-05和L-08經(jīng)除草劑草丁膦噴施篩選、篩選標(biāo)記Bar基因的PCR檢測(cè)、目的基因GmWRKY70的PCR檢測(cè)、以及載體構(gòu)建特異性PCR檢測(cè)等,初步確定GmWRKY70已經(jīng)成功地整合到了大豆基因組中。2、基于反向PCR技術(shù)的T-DNA整合位點(diǎn)分析。利用反向PCR技術(shù)對(duì)以上獲得的L-05和L-08兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系T-DNA整合位點(diǎn)側(cè)翼的大豆染色體上的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增。序列對(duì)比分析和進(jìn)一步的T-DNA整合位點(diǎn)的PCR驗(yàn)證表明：L-05株系T-DNA區(qū)域正向整合在大豆基因組的第10染色體40,530,783 bp之后,L-08株系T-DNA區(qū)域正向整合在大豆基因組的第13染色體35,524,968 bp之后。
【關(guān)鍵詞】：大豆 GmWRKY70 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法 T-DNA整合位點(diǎn)
【學(xué)位授予單位】：浙江師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q943.2;S565.1
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 1 文獻(xiàn)綜述11-23
• 1.1 WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子的研究進(jìn)展12-17
• 1.1.1 WRKY轉(zhuǎn)錄因子概述12-13
• 1.1.2 WRKY轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)13-14
• 1.1.2.1 WRKY結(jié)構(gòu)域13-14
• 1.1.2.2 WRKY蛋白與W盒14
• 1.1.3 WRKY轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)功能14-16
• 1.1.3.1 WRKY轉(zhuǎn)錄因子對(duì)生物脅迫的響應(yīng)14-15
• 1.1.3.2 WRKY轉(zhuǎn)錄因子對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)15-16
• 1.1.3.3 WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的響應(yīng)16
• 1.1.4 大豆WRKY轉(zhuǎn)錄因子研究進(jìn)展16-17
• 1.2 大豆遺傳轉(zhuǎn)化方法研究17-19
• 1.2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法17-18
• 1.2.2 基因槍法18
• 1.2.3 電擊法18
• 1.2.4 聚乙二醇法18-19
• 1.2.5 花粉管通道法19
• 1.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆遺傳轉(zhuǎn)化的主要影響因素19-21
• 1.3.1 基因型的選擇19-20
• 1.3.2 農(nóng)桿菌菌株的選擇20
• 1.3.3 篩選標(biāo)記基因的選擇20-21
• 1.4 轉(zhuǎn)基因大豆的食用和環(huán)境安全性研究21-23
• 2 大豆植株耐鹽簡(jiǎn)易鑒定方法探索23-31
• 2.1 材料與方法23-24
• 2.1.1 試驗(yàn)材料23
• 2.1.2 試驗(yàn)方法23-24
• 2.2 結(jié)果與分析24-29
• 2.2.1 鹽脅迫對(duì)不同大豆基因型植株高度的影響24
• 2.2.2 鹽脅迫對(duì)不同大豆基因型主根長(zhǎng)度的影響24-25
• 2.2.3 鹽脅迫對(duì)不同大豆基因型植株鮮重的影響25-27
• 2.2.4 鹽脅迫對(duì)不同大豆基因型植株干重的影響27-29
• 2.2.5 鹽脅迫對(duì)不同大豆基因型萎蔫率的影響29
• 2.3 討論29-31
• 3 GmWRKY70基因的遺傳轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)基因植株的鑒定篩選31-44
• 3.1 材料與方法31-38
• 3.1.1 材料32-34
• 3.1.1.1 植物材料32
• 3.1.1.2 主要化學(xué)試劑及藥品溶液配制32-33
• 3.1.1.3 培養(yǎng)基配方33-34
• 3.1.1.4 主要儀器設(shè)備34
• 3.1.2 方法34-38
• 3.1.2.1 種子消毒34
• 3.1.2.2 種子萌發(fā)34-35
• 3.1.2.3 共生菌制備35
• 3.1.2.4 外植體的制備和共培養(yǎng)35
• 3.1.2.5 抗性芽的誘導(dǎo)35-36
• 3.1.2.6 叢生芽的伸長(zhǎng)36
• 3.1.2.7 生根培養(yǎng)36
• 3.1.2.8 植株的馴化與移栽36-37
• 3.1.2.9 DNA提取與PCR檢測(cè)37-38
• 3.2 結(jié)果與分析38-41
• 3.2.1 大豆的遺傳轉(zhuǎn)化38-39
• 3.2.2 轉(zhuǎn)基因大豆幼苗的草丁膦抗性篩選39
• 3.2.3 轉(zhuǎn)基因大豆的分子檢測(cè)39-41
• 3.3 討論41-44
• 4 基于反向PCR技術(shù)的T-DNA整合位點(diǎn)分析44-54
• 4.1 材料與方法44-47
• 4.1.1 材料44-45
• 4.1.2 大豆基因組DNA的提取45
• 4.1.3 反向PCR引物設(shè)計(jì)與酶切位點(diǎn)選擇45-46
• 4.1.4 DNA的酶切和酶切片段的環(huán)化46
• 4.1.5 兩輪巢式反向PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物克隆測(cè)序46
• 4.1.6 序列對(duì)比分析46-47
• 4.1.7 T-DNA整合位點(diǎn)驗(yàn)證47
• 4.2 結(jié)果與分析47-52
• 4.2.1 反向PCR擴(kuò)增47-48
• 4.2.2 基于反向PCR的T-DNA整合位點(diǎn)分析48-50
• 4.2.3 T-DNA整合位點(diǎn)的PCR驗(yàn)證50-52
• 4.3 討論52-54
• 參考文獻(xiàn)54-69
• 附錄A 縮寫詞69-71
• 攻讀學(xué)位期間取得的研究成果71-73
• 致謝73-75

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