本文關(guān)鍵詞：乳酸菌對空腸彎曲桿菌毒力基因表達(dá)的影響

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【摘要】：空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni,C.jejuni)為全球范圍內(nèi)一種重要的人畜共患食源性致病菌,廣泛存在于各種動物體內(nèi),其中雞是C.jejuni攜帶率最高的動物,C.jejuni可通過食物鏈傳播,是腹瀉最常見的病原菌之一。目前頻繁使用的抗生素導(dǎo)致了致病菌耐藥性問題日益嚴(yán)重。由于乳酸菌的安全無副作用,使用乳酸菌控制食品中的致病菌污染的方法正逐漸受到關(guān)注。本研究擬從菌種保藏庫及雞糞中篩選具有拮抗C.jejuni能力的乳酸菌,研究其腸道益生特性,并探討其在體內(nèi)外對C.jejuni毒力基因表達(dá)的影響及在體內(nèi)對C.jejuni感染的預(yù)防作用,對C.jejuni的預(yù)防及人體健康有著重大意義。篩選體內(nèi)外能有效拮抗C.jejuni及抑制其毒力基因表達(dá)的乳酸菌。以菌種保藏庫中的112株乳酸菌和雞糞中分離得到80株菌株為篩選來源,使用牛津杯抑菌實(shí)驗(yàn)初步篩選得到10株對C.jejuni生長具有較強(qiáng)抑制作用的乳酸菌;通過HT-29細(xì)胞的粘附能力檢測,人工模擬胃腸液的耐受性考察,及對C.jejuni的flaA、ciaB、cdtB、pldA及cadF基因表達(dá)影響的探討,進(jìn)一步篩選獲得羅伊氏乳桿菌X13。該菌株具有較強(qiáng)抑制C.jejuni生長的能力,粘附指數(shù)達(dá)到11.5個/細(xì)胞,經(jīng)2 h人工胃腸液處理后活菌數(shù)無數(shù)量級上的變化,在體外對C.jejuni的ciaB及pldA基因表達(dá)的調(diào)控作用不顯著,但能顯著下調(diào)C.jejuni的flaA、cdtB及cadF基因的表達(dá),其中對編碼鞭毛蛋白的flaA基因表達(dá)的抑制作用最強(qiáng)。對羅伊氏乳桿菌X13無細(xì)胞提取物(Cell free spent medium,CFSM)中調(diào)控C.jejuni編碼鞭毛蛋白的flaA基因表達(dá)的主要物質(zhì)進(jìn)行了初步研究。通過掃描電子顯微鏡(Scanning electron microscope,SEM)觀察發(fā)現(xiàn)X13純培養(yǎng)無細(xì)胞提取物(CFSM)處理后C.jejuni的鞭毛長度顯著低于對照組,表明X13 CFSM會抑制C.jejuni鞭毛合成。分別對X13 CFSM進(jìn)行熱處理、過氧化氫酶預(yù)處理、蛋白酶預(yù)處理發(fā)現(xiàn)其對flaA基因表達(dá)的調(diào)控作用與未處理組相比變化不顯著,表明X13 CFSM調(diào)控flaA基因表達(dá)的物質(zhì)具有熱穩(wěn)定性且不是過氧化氫及蛋白類物質(zhì);通過堿中和X13 CFSM發(fā)現(xiàn)其抑制flaA基因表達(dá)的能力顯著下降,但中和后的X13 CFSM對flaA基因的表達(dá)與對照組相比仍有顯著抑制作用,表明羅伊氏乳桿菌純培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸類物質(zhì)對flaA基因的表達(dá)具有顯著的抑制作用,但除有機(jī)酸外還存在其他抑制因素。采用人結(jié)腸癌上皮細(xì)胞系HT-29細(xì)胞考察羅伊氏乳桿菌X13對C.jejuni的毒力基因及HT-29細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的影響。結(jié)果顯示羅伊氏乳桿菌X13能顯著下調(diào)flaA、ciaB、cdtB及cadF的表達(dá),而對pldA表達(dá)的調(diào)控作用不顯著;檢測HT-29細(xì)胞中細(xì)胞因子(IL-1β、IL-8、IL-10及TNF-α)的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)羅伊氏乳桿菌X13能調(diào)控由于C.jejuni感染導(dǎo)致的HT-29細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)變化,使其向空白組水平恢復(fù)。通過小鼠模型研究羅伊氏乳桿菌X13在體內(nèi)對C.jejuni毒力基因表達(dá)的影響,及對C.jejuni感染小鼠的預(yù)防作用。通過連續(xù)灌胃3周C.jejuni構(gòu)建小鼠的C.jejuni感染模型,結(jié)果顯示,C.jejuni在停止灌胃的2周內(nèi)能持續(xù)定植于小鼠體內(nèi),感染C.jejuni后小鼠的體重增長減緩,脾臟指數(shù)減小,空腸、盲腸及結(jié)腸中細(xì)胞因子IL-1β、IL-8、IL-10及TNF-α的表達(dá)量與空白組差異顯著,引發(fā)腸道炎癥。提前1周用羅伊氏乳桿菌X13預(yù)防的小鼠各項(xiàng)指標(biāo)均向空白組恢復(fù),且其盲腸段毒力基因flaA、ciaB、cdtB的表達(dá)較C.jejuni感染組顯著下調(diào),而pldA、cadF基因表達(dá)差異不顯著。綜上,羅伊氏乳桿菌X13在小鼠體內(nèi)能調(diào)控C.jejuni毒力基因的表達(dá),且對C.jejuni感染引起的腸道炎癥有緩解作用。
【關(guān)鍵詞】：乳酸菌 調(diào)控 空腸彎曲桿菌 毒力基因
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：TS201.3
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 1 緒論9-18
• 1.1 空腸彎曲桿菌概述9
• 1.2 空腸彎曲桿菌的致病機(jī)制及毒力因子研究9-11
• 1.2.1 纖連結(jié)合蛋白10
• 1.2.2 鞭毛蛋白10
• 1.2.3 侵入抗原蛋白10
• 1.2.4 磷脂酶活性蛋白10-11
• 1.2.5 細(xì)胞致死性膨脹毒素11
• 1.3 空腸彎曲桿菌的感染及治療11
• 1.4 乳酸菌拮抗空腸彎曲桿菌的研究11-12
• 1.5 乳酸菌干預(yù)病原菌感染的作用機(jī)制12-14
• 1.5.1 產(chǎn)生抗菌物質(zhì)抑制病原菌的生長12-13
• 1.5.2 抑制病原菌的粘附13
• 1.5.3 調(diào)節(jié)腸粘膜物理屏障13
• 1.5.4 免疫調(diào)節(jié)作用13-14
• 1.6 乳酸菌對病原菌毒力基因表達(dá)的影響14
• 1.7 具有調(diào)控病原菌毒力基因表達(dá)的乳酸菌的篩選指標(biāo)及方法研究14-16
• 1.7.1 抑菌能力15
• 1.7.2 粘附能力15
• 1.7.3 耐受胃酸及膽鹽能力15
• 1.7.4 調(diào)控病原菌毒力基因表達(dá)15-16
• 1.8 立題背景與意義16
• 1.9 本課題研究的主要內(nèi)容16-18
• 2 材料與方法18-28
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料18-20
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株和細(xì)胞株18
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)動物18
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)材料與試劑18
• 2.1.4 主要試劑的配制18-19
• 2.1.5 主要儀器與設(shè)備19-20
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法20-28
• 2.2.1 雞糞中乳酸菌的分離20
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)菌株的培養(yǎng)及其發(fā)酵上清液和菌懸液的制備20
• 2.2.3 具有拮抗空腸彎曲桿菌能力的乳酸菌的篩選及鑒定20-21
• 2.2.4 乳酸菌對細(xì)胞粘附能力的測定21-22
• 2.2.5 乳酸菌對人工胃腸液耐受能力的測定22
• 2.2.6 乳酸菌對空腸彎曲桿菌毒力因子表達(dá)的影響22-24
• 2.2.7 羅伊氏乳桿菌X13 CFSM調(diào)控flaA基因表達(dá)物質(zhì)的初步研究24
• 2.2.8 羅伊氏乳桿菌X13 CFSM對HT-29細(xì)胞空腸彎曲桿菌感染的干預(yù)作用24-25
• 2.2.9 羅伊氏乳桿菌X13對小鼠空腸彎曲桿菌感染的預(yù)防作用25-27
• 2.2.10 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析27-28
• 3 結(jié)果與討論28-50
• 3.1 具有拮抗空腸彎曲桿菌及調(diào)控其毒力基因表達(dá)的乳酸菌的篩選28-39
• 3.1.1 空腸彎曲桿菌生長曲線28
• 3.1.2 具有拮抗空腸彎曲桿菌能力的乳酸菌的篩選及鑒定28-33
• 3.1.3 乳酸菌對細(xì)胞粘附能力的測定33-34
• 3.1.4 乳酸菌對人工胃腸液的耐受能力34-35
• 3.1.5 乳酸菌對空腸彎曲桿菌毒力因子表達(dá)的影響35-39
• 3.2 羅伊氏乳桿菌X13 CFSM調(diào)控flaA基因表達(dá)物質(zhì)的初步研究39-43
• 3.2.1 羅伊氏乳桿菌X13 CFSM對空腸彎曲桿菌鞭毛合成的影響39-40
• 3.2.2 熱處理對羅伊氏乳桿菌X13 CFSM調(diào)控flaA基因表達(dá)的影響40-41
• 3.2.3 過氧化氫酶處理對羅伊氏乳桿菌X13 CFSM調(diào)控flaA基因表達(dá)的影響41-42
• 3.2.4 蛋白酶處理對羅伊氏乳桿菌X13 CFSM調(diào)控flaA基因表達(dá)的影響42
• 3.2.5 調(diào)pH對羅伊氏乳桿菌X13 CFSM調(diào)控flaA基因表達(dá)的影響42-43
• 3.3 羅伊氏乳桿菌X13 CFSM對HT-29細(xì)胞感染空腸彎曲桿菌的干預(yù)作用43-46
• 3.3.1 空腸彎曲桿菌毒力因子表達(dá)情況43-44
• 3.3.2 細(xì)胞因子表達(dá)情況44-46
• 3.4 羅伊氏乳桿菌X13對小鼠感染空腸彎曲桿菌的預(yù)防作用46-50
• 3.4.1 空腸彎曲桿菌在小鼠體內(nèi)的定植情況46
• 3.4.2 羅伊氏乳桿菌X13對感染空腸彎曲桿菌小鼠體重的影響46-47
• 3.4.3 羅伊氏乳桿菌X13對感染空腸彎曲桿菌小鼠脾臟指數(shù)的影響47
• 3.4.4 羅伊氏乳桿菌X13在小鼠體內(nèi)對空腸彎曲桿菌毒力基因表達(dá)的影響47-48
• 3.4.5 羅伊氏乳桿菌X13對小鼠腸道組織中細(xì)胞因子的影響48-50
• 主要結(jié)論與展望50-52
• 致謝52-53
• 參考文獻(xiàn)53-60
• 附錄A：作者在攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文60-61
• 附錄B：其他數(shù)據(jù)61

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