本文關(guān)鍵詞：黃綠木霉內(nèi)切葡聚糖酶Ⅱ基因的克隆與表達(dá)

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【摘要】：隨著能源的匱乏,纖維素作為可再生資源,含量豐富,纖維素酶水解纖維素成小分子物質(zhì)生產(chǎn)燃料乙醇是當(dāng)前刻不容緩的問題。微生物降解纖維素為人類利用纖維素資源提供了可能。在地球上,真菌中的木霉屬是分泌纖維素酶較多的微生物。本文以黃綠木霉(Trichoderma atroviride)AS3.3013菌株為實驗材料,采用RT-PCR方法克隆出內(nèi)切葡聚糖酶(EGⅡ)基因的cDNA序列,經(jīng)測序為完整序列,在GenBank數(shù)據(jù)庫登錄號為KP098496,序列長度為1257bp,編碼418個氨基酸,理論分子量為44.21k Da,理論等電點為4.96,信號肽為N端的21個氨基酸,是糖苷水解酶家族5的一種胞外酶。為了實現(xiàn)纖維素酶的高效表達(dá),本研究構(gòu)建了一種釀酒酵母高效重組表達(dá)載體YPIGH,將克隆到的EGⅡ基因連接到表達(dá)載體YPIGH和游離表達(dá)載體p YES2上,獲得重組質(zhì)粒YPIGH-EGⅡ和p YES2-EGⅡ,將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)INVScⅠ中,測定內(nèi)切葡聚糖酶酶活后,發(fā)現(xiàn)YPIGH-EGⅡ的酶活力比游離載體p YES2-EGⅡ的酶活提高了1.29倍。酵母轉(zhuǎn)化子通過β-半乳糖誘導(dǎo)后,利用SDS-PAGE電泳分析,結(jié)果表明表達(dá)出目的蛋白,且大小基本符合理論值。研究采用實時熒光定量PCR的方法探究了黃綠木霉經(jīng)不同底物誘導(dǎo)后的表達(dá)量和釀酒酵母轉(zhuǎn)化子經(jīng)β-半乳糖誘導(dǎo)后的表達(dá)量,研究表明:黃綠木霉在微晶纖維素(MCC)誘導(dǎo)下表達(dá)量最高,釀酒酵母轉(zhuǎn)化子在第四天表達(dá)量最大。對重組釀酒酵母轉(zhuǎn)子發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,優(yōu)化得到最佳產(chǎn)酶條件為:β-半乳糖含量為3%,YNB含量為0.84%,通氧量為100m L,培養(yǎng)溫度為29℃時,重組釀酒酵母產(chǎn)酶量最大,最大產(chǎn)酶活性為116.10U/g。采用DNS法測定重組酶的酶活及酶動力學(xué)常數(shù)。結(jié)果顯示:酶活最適溫度為60℃,最適p H為5.0,在40-60℃范圍內(nèi)酶活穩(wěn)定,p H在4.0-7.0之間具有較好的穩(wěn)定性,Ag+對重組酶具有較強的激活作用,Co2+具有較強的抑制作用,蜜三糖為最佳底物。
【關(guān)鍵詞】：黃綠木霉 內(nèi)切葡聚糖酶 克隆 表達(dá) 酶學(xué)特性
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q78;Q936
【目錄】：

• 摘要10-11
• 英文摘要11-12
• 1 前言12-20
• 1.1 纖維素和纖維素酶12-15
• 1.1.1 纖維素12-13
• 1.1.2 纖維素復(fù)合酶13-15
• 1.2 產(chǎn)生纖維素酶的生物15-16
• 1.2.1 真菌產(chǎn)生的纖維素酶15
• 1.2.2 細(xì)菌產(chǎn)生的纖維素酶15
• 1.2.3 放線菌產(chǎn)生的纖維素酶15-16
• 1.2.4 動物產(chǎn)生的纖維素酶16
• 1.3 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀16-17
• 1.4 纖維素酶在工業(yè)上的應(yīng)用17-18
• 1.4.1 纖維素酶應(yīng)用在紡織業(yè)上17
• 1.4.2 纖維素酶應(yīng)用在食品業(yè)上17
• 1.4.3 纖維素酶應(yīng)用在飼料業(yè)上17-18
• 1.4.4 纖維素酶應(yīng)用在生物能源上18
• 1.4.5 纖維素酶應(yīng)用在造紙業(yè)上18
• 1.5 研究目的及意義18-19
• 1.6 本研究的技術(shù)路線19-20
• 2 材料與方法20-41
• 2.1 實驗材料20-25
• 2.1.1 菌株與質(zhì)粒20-22
• 2.1.2 藥品及酶類22
• 2.1.3 試劑及配方22-25
• 2.1.4 實驗儀器25
• 2.2 實驗方法25-41
• 2.2.1 黃綠木霉的培養(yǎng)25
• 2.2.2 內(nèi)切葡聚糖酶基因的克隆25-29
• 2.2.3 基因生物信息學(xué)分析29
• 2.2.4 釀酒酵母重組載體的構(gòu)建29-32
• 2.2.5 酶切與連接32-34
• 2.2.6 釀酒酵母轉(zhuǎn)化34-35
• 2.2.7 內(nèi)切葡聚糖酶的誘導(dǎo)表達(dá)及分析35-36
• 2.2.8 重組酶的誘導(dǎo)表達(dá)及分析36
• 2.2.9 重組酶的酶學(xué)特性及動力學(xué)分析36-39
• 2.2.10 重組轉(zhuǎn)化子發(fā)酵條件的優(yōu)化39-41
• 3 結(jié)果與分析41-64
• 3.1 內(nèi)切葡聚糖酶基因的克隆41-43
• 3.1.1 黃綠木霉總DNA和RNA的提取41
• 3.1.2 基因的克隆41-43
• 3.2 基因序列分析43-46
• 3.2.1 內(nèi)切葡聚糖酶Ⅱ基因序列的分析43-44
• 3.2.2 內(nèi)切葡聚糖酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析44-46
• 3.3 釀酒酵母整合載體YPIGH的構(gòu)建46-48
• 3.3.1PCR擴增序列46-47
• 3.3.2 載體雙酶切的鑒定47-48
• 3.4 重組表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化48-50
• 3.4.1 構(gòu)建游離表達(dá)質(zhì)粒48-49
• 3.4.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建49
• 3.4.3 表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化49-50
• 3.4.4 釀酒酵母轉(zhuǎn)化子的鑒定50
• 3.5 內(nèi)切葡聚糖酶基因的誘導(dǎo)表達(dá)及分析50-52
• 3.5.1 黃綠木霉RNA提取50-51
• 3.5.2 黃綠木霉c DNA的驗證51
• 3.5.3 基因的實時熒光定量PCR51-52
• 3.6 重組酶的誘導(dǎo)表達(dá)及分析52
• 3.7 酶學(xué)特性及動力學(xué)常數(shù)分析52-61
• 3.7.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線52-53
• 3.7.2 重組蛋白的SDS-PAGE和水解圈分析53-54
• 3.7.3 重組內(nèi)切葡聚糖酶的酶學(xué)特性分析54-56
• 3.7.4 酶促動力學(xué)分析56-61
• 3.8 內(nèi)切葡聚糖酶的發(fā)酵條件優(yōu)化61-64
• 3.8.1β-半乳糖含量對酶活性影響的分析61
• 3.8.2YNB含量對酶活性影響的分析61-62
• 3.8.3 通氧量對酶活性影響的分析62
• 3.8.4 溫度對酶活性影響的分析62
• 3.8.5 重組釀酒酵母發(fā)酵條件的正交實驗62-64
• 4 討論64-67
• 4.1 內(nèi)切葡聚糖酶基因的克隆64
• 4.1.1 基因供體的選擇64
• 4.1.2 基因生物信息學(xué)分析64
• 4.2 內(nèi)切葡聚糖酶基因的表達(dá)64-67
• 4.2.1 基因表達(dá)系統(tǒng)的選擇64-65
• 4.2.2 制約外源基因表達(dá)的因素65
• 4.2.3 關(guān)于構(gòu)建高效表達(dá)載體方面的討論65-66
• 4.2.4 內(nèi)切葡聚糖酶誘導(dǎo)表達(dá)的研究66
• 4.2.5 內(nèi)切葡聚糖酶酶學(xué)特性分析66
• 4.2.6 內(nèi)切葡聚糖酶發(fā)酵條件的優(yōu)化66-67
• 5 結(jié)論67-68
• 致謝68-69
• 參考文獻(xiàn)69-76
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文76

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