本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良家畜的現(xiàn)狀與趨勢(shì)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)》 2009年

體細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)ω-3脂肪酸去飽和酶基因豬

馮沖  

【摘要】： 豬肉是人類(lèi)重要的動(dòng)物性食品,豬肉中所含多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFAs)大部分為ω-6 PUFAs,而對(duì)人體健康有重要價(jià)值的ω-3 PUFAs含量較少。本研究利用體細(xì)胞核移植技術(shù)首次成功生產(chǎn)了轉(zhuǎn)ω-3脂肪酸去飽和酶基因(sFat-1)克隆豬,結(jié)果如下: 實(shí)驗(yàn)一:采用組織塊培養(yǎng)法,建立了7個(gè)38日胎齡的純種英系大白豬胎兒成纖維細(xì)胞系;細(xì)胞接觸抑制2 d后,經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn), 80%以上的細(xì)胞處于G0/G1期。 實(shí)驗(yàn)二:利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法,將sFat-1基因轉(zhuǎn)染至大白豬胎兒成纖維細(xì)胞,并對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及篩選條件進(jìn)行了優(yōu)化。通過(guò)大白豬胎兒成纖維細(xì)胞對(duì)G418敏感性檢測(cè)發(fā)現(xiàn),600μg/mL的G418可以在7 d內(nèi)將細(xì)胞全部殺死,因此篩選時(shí)選擇該濃度較為合適。比較了脂質(zhì)體采用與DNA的比例分別為10μL : 3μg、10μL : 4μg、10μL : 6μg和10μL : 7μg時(shí)的轉(zhuǎn)染效率,其中脂質(zhì)體與DNA的比例控制在10μL:4μgm時(shí),篩選后所得細(xì)胞克隆數(shù)最高(20個(gè));對(duì)篩選出的G418抗性細(xì)胞克隆中狀態(tài)較好的18個(gè)進(jìn)行了PCR及RT-PCR檢測(cè),PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:18、3、6、12、16及17號(hào)克隆點(diǎn)細(xì)胞,為轉(zhuǎn)基因陰性細(xì)胞;再利用RT-PCR對(duì)剩余12個(gè)PCR陽(yáng)性克隆點(diǎn)的細(xì)胞進(jìn)行RNA表達(dá)水平檢測(cè),結(jié)果4號(hào)克隆點(diǎn)的RNA表達(dá)量極低,認(rèn)定其為轉(zhuǎn)基因陰性,其余11個(gè)為陽(yáng)性。 實(shí)驗(yàn)三:為了提高克隆胚胎的發(fā)育能力,將卵巢上的卵泡按直徑分為大卵泡(直徑4-6 mm)及小卵泡(直徑2-3 mm)兩組,體外成熟38 - 42 h后作為胞質(zhì)受體,以胚胎的卵裂率和囊胚率為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn),評(píng)價(jià)卵泡大小及成熟時(shí)間(卵齡)對(duì)卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量的影響;胚胎輔助激活上,比較了胚胎輔助激活采用電激活和CHX化學(xué)激活對(duì)胚胎發(fā)育的影響。結(jié)果,卵齡40 h的大卵泡卵母細(xì)胞的囊胚發(fā)育率(19.3±1.7%,P 0.05)顯著高于其它各組,42 h的小卵泡卵母細(xì)胞的囊胚率次之(11.0±1.3%);CHX化學(xué)輔助激活能提高胚胎的囊胚率,并且能夠顯著提高小卵泡胚胎的囊胚發(fā)育率(P 0.05),但大卵泡組胚胎囊胚率未見(jiàn)顯著提高。實(shí)驗(yàn)四:以鑒定為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性的細(xì)胞為核供體,體外成熟的卵母細(xì)胞為胞質(zhì)受體構(gòu)建克隆胚胎,胚胎經(jīng)體外培養(yǎng)后進(jìn)行胚胎移植,共移植1889枚1-4細(xì)胞期克隆胚胎到10頭受體母豬的輸卵管內(nèi),28天B超檢測(cè)9頭受體母豬妊娠(90%),7頭妊娠足月(70%)分娩產(chǎn)下21頭仔豬,體細(xì)胞克隆豬的效率為1.1%(出生仔豬/移植胚胎)。對(duì)健康存活15頭克隆豬進(jìn)行了PCR和Southern檢測(cè),證實(shí)13頭為轉(zhuǎn)基因豬,轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性率為87%。RT-PCR檢測(cè)13頭轉(zhuǎn)基因豬,12頭表達(dá)sFat-1基因。 上述結(jié)果表明,利用SCNT可以有效的生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬,并且通過(guò)對(duì)供體細(xì)胞的轉(zhuǎn)染、篩選及鑒定,可使轉(zhuǎn)基因效率達(dá)到較高水平。轉(zhuǎn)sFat-1基因克隆豬的誕生,為探索通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段改善豬肉品質(zhì)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類(lèi)號(hào)】：S828;Q819
【目錄】：

摘要6-8

Summary8-13

第一章 文獻(xiàn)綜述13-32

1 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制作與應(yīng)用14-18

1.1 動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究進(jìn)展14-16

1.2 動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用16-17

1.3 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因存在的問(wèn)題17-18

2 動(dòng)物體細(xì)胞克隆技術(shù)18-27

2.1 動(dòng)物克隆研究的簡(jiǎn)要回顧18

2.2 動(dòng)物體細(xì)胞克隆技術(shù)的方法18-22

2.3 體細(xì)胞克隆豬及其應(yīng)用22-24

2.4 轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆技術(shù)24-25

2.5 動(dòng)物克隆存在的問(wèn)題25-27

3 多不飽和脂肪酸的功能及其基因工程研究進(jìn)展27-31

3.1 PUFAs 概述27

3.2 ω-3 和ω-6 多不飽和脂肪酸的生理功能27-28

3.3 ω-6 和ω-3PUFAs 的生物合成28-29

3.4 ω-3 PUFAs 的基因工程合成的研究進(jìn)展29-31

4 本研究的目的和意義31-32

4.1 研究目的31

4.2 研究意義31-32

第二章 試驗(yàn)部分32-58

1 大白豬胎兒成纖維細(xì)胞系建立32-38

前言32

1.1 材料與方法32-35

1.2 結(jié)果35-37

1.3 討論37-38

2 sFat-1 基因轉(zhuǎn)染大白豬胎兒成纖維細(xì)胞的研究38-44

前言38

2.1 材料與方法38-40

2.2 結(jié)果與分析40-42

2.3 討論42-44

3 卵泡直徑及輔助激活方式對(duì)克隆胚胎發(fā)育能力的影響44-52

前言44-45

3.1 材料與方法45-48

3.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)48

3.3 結(jié)果48-50

3.4 討論50-52

4 轉(zhuǎn)ω-3 脂肪酸去飽和酶基因sFat-1 克隆豬的生產(chǎn)52-58

前言52-53

4.1 材料與方法53-54

4.2 結(jié)果54-56

4.3 討論56-58

第三章 結(jié)論58-59

參考文獻(xiàn)59-65

致謝65-66

導(dǎo)師簡(jiǎn)介66-68

作者簡(jiǎn)歷68

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【引證文獻(xiàn)】

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2 孫秀柱,李青旺,戴蘊(yùn)平,程金華,龔國(guó)春,萬(wàn)榮,朱化彬;魯西黃牛皮膚成纖維細(xì)胞分離與培養(yǎng)的研究[J];中國(guó)畜牧獸醫(yī);2004年12期

3 潘登科;牟玉蓮;潘求真;萬(wàn)榮;劉吉;張莉;馮書(shū)堂;;不同類(lèi)型的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞為核供體生產(chǎn)豬的轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白基因克隆胚胎[J];廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué);2006年S1期

4 龔國(guó)春,戴蘊(yùn)平,朱化彬,王海平,王莉莉,李榮,萬(wàn)榮,劉穎,李寧;供體細(xì)胞類(lèi)型對(duì)體細(xì)胞克隆牛生產(chǎn)效率的影響[J];中國(guó)科學(xué)(C輯:生命科學(xué));2004年03期

5 雷安民,高志敏,楊春榮,竇忠英;牛卵母細(xì)胞去核方法的研究[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào);2000年04期

6 施履吉;有關(guān)免疫學(xué)研究的兩點(diǎn)設(shè)想[J];上海免疫學(xué)雜志;1997年06期

7 朱貴明;陳宏;周艷榮;盧建申;吳曉潔;陳紅星;鄧?yán)^先;;來(lái)源于線蟲(chóng)Caenorhabditis briggssae的ω-3脂肪酸去飽和酶基因的合成及其功能分析[J];生物工程學(xué)報(bào);2006年05期

8 黃未未,湯雪明;轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及其應(yīng)用[J];生命科學(xué);1998年04期

9 錢(qián)云,師蔚群,朱猛進(jìn),丁家桐,范必勤,YutakaFUKUI;卵泡內(nèi)環(huán)境對(duì)豬卵泡卵體外成熟和發(fā)育的影響[J];生命科學(xué)研究;2001年02期

10 張德福,王英,陳茵,王凱,KarlSchellander,LinCailu;影響豬體細(xì)胞核移植重構(gòu)胚體外發(fā)育的若干因素[J];實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào);2003年01期

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 盧蘇燕;中法利用新技術(shù)成功培育出體細(xì)胞克隆牛[J];四川畜牧獸醫(yī);2001年02期

2 ;科技[J];飼料廣角;2007年23期

3 ;華南農(nóng)業(yè)大學(xué)成功培育成粵首例體細(xì)胞克隆豬[J];廣東農(nóng)業(yè)科學(xué);2008年06期

4 ;我國(guó)首個(gè)體細(xì)胞克隆牛胚胎移植中心成立[J];生物學(xué)通報(bào);2004年09期

5 李擁軍,薛慧文;哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆的研究與應(yīng)用[J];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2003年03期

6 張德福;劉東;吳華麗;陳學(xué)進(jìn);王凱;陳瑩;;豬作為異種器官移植供體的研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)[J];豬業(yè)科學(xué);2006年07期

7 ;中國(guó)克隆豬[J];青島畫(huà)報(bào);2007年02期

8 ;世界首批亞種間體細(xì)胞克隆羊試驗(yàn)在上海獲成功[J];當(dāng)代畜牧;2005年12期

9 ;日本成功克隆已故"名牛"[J];畜牧獸醫(yī)科技信息;2009年01期

10 ;轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆奶山羊成功[J];湖南畜牧獸醫(yī);2002年06期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 黃永業(yè);譚廣云;謝萬(wàn)華;周炎;李棟;賴(lài)良學(xué);逄大欣;歐陽(yáng)紅生;;規(guī)�；w細(xì)胞克隆豬生產(chǎn)的探討[A];全國(guó)動(dòng)物生理生化第十一次學(xué)術(shù)交流會(huì)論文摘要匯編[C];2010年

2 朱姿英;楊小淦;盧晟盛;陸陽(yáng)清;盧克煥;;豬體細(xì)胞克隆安全性評(píng)估及其產(chǎn)業(yè)化研究進(jìn)展—以牛體細(xì)胞克隆產(chǎn)業(yè)化為鑒[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物繁殖學(xué)分會(huì)第十五屆學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集（上冊(cè)）[C];2010年

3 王曉麗;蔣建榮;徐莉萍;房慧伶;辛立江;石德順;;一例體細(xì)胞克隆水牛肺、脾臟的組織結(jié)構(gòu)觀察[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物解剖學(xué)及組織胚胎學(xué)分會(huì)第十六次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2010年

4 宋少康;董雅娟;柏學(xué)進(jìn);牛召珊;朱孟芝;;體細(xì)胞克隆在肉牛育種上的研究進(jìn)展及展望[A];2010中國(guó)牛業(yè)進(jìn)展[C];2010年

5 張運(yùn)海;劉亞;王維;陶勇;章孝榮;;體細(xì)胞克隆技術(shù)與安徽奶牛良種化[A];現(xiàn)代農(nóng)業(yè)理論與實(shí)踐——安徽現(xiàn)代農(nóng)業(yè)博士科技論壇論文集[C];2007年

6 劉麗梅;高飛;張鵬;安培培;宋光啟;湯黎娜;唐博;李子義;;丁酸鈉對(duì)豬體細(xì)胞克隆胚胎重編程及組蛋白乙�；挠绊慬A];“細(xì)胞活動(dòng) 生命活力”——中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)全體會(huì)員代表大會(huì)暨第十二次學(xué)術(shù)大會(huì)論文摘要集[C];2011年

7 雷安民;敬曉棋;嚴(yán)興榮;胥濤;竇忠英;;體細(xì)胞克隆胚胎形態(tài)與質(zhì)量相關(guān)性的研究[A];全國(guó)首屆動(dòng)物生物技術(shù)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2004年

8 胡軍和;楊春榮;雷安民;敬曉棋;竇忠英;;體細(xì)胞克隆豬的研究進(jìn)展(英文)[A];全國(guó)首屆動(dòng)物生物技術(shù)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2004年

9 茍克勉;安曉榮;陳永福;;體細(xì)胞克隆法生產(chǎn)綿羊轉(zhuǎn)基因囊胚[A];中國(guó)生物工程學(xué)會(huì)第三次全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要集[C];2001年

10 劉鳳軍;王秀愛(ài);莊益芬;葉屹峰;余翠月;洪志勇;陳梅芳;陳曦;謝旭東;張文昌;;微電極融合法對(duì)豬體細(xì)胞克隆胚胎融合激活及胚胎發(fā)育的影響[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物繁殖學(xué)分會(huì)第十五屆學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集（上冊(cè)）[C];2010年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 王柏濤　于永生 記者 于寧;[N];吉林日?qǐng)?bào);2011年

2 通訊員 樂(lè)良 成修 記者 詩(shī)星 野軍;[N];煙臺(tái)日?qǐng)?bào);2009年

3 林樂(lè)良　記者 操秀英;[N];科技日?qǐng)?bào);2009年

4 記者 王世煥;[N];新華每日電訊;2000年

5 周華、王立芳;[N];人民日?qǐng)?bào)海外版;2005年

6 通訊員紀(jì)和春記者王建高;[N];科技日?qǐng)?bào);2002年

7 記者 張可喜;[N];新華每日電訊;2002年

8 本報(bào)記者 操秀英;[N];科技日?qǐng)?bào);2009年

9 記者　趙秋麗　特約記者　李志臣;[N];光明日?qǐng)?bào);2003年

10 記者范建通訊員才杰;[N];科技日?qǐng)?bào);2002年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 蘇建民;牛體細(xì)胞克隆中異常重編程的分析及提高重編程效率的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2012年

2 楊月春;延邊黃牛體細(xì)胞克隆胚胎氧化損傷的研究[D];延邊大學(xué);2010年

3 朱化彬;奶牛體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)的研究[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

4 屈婭;基于細(xì)胞電融合技術(shù)的體細(xì)胞重編程研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2012年

5 柳海星;轉(zhuǎn)人血清白蛋白延邊奶山羊—綿羊體細(xì)胞克隆胚胎生產(chǎn)體系的優(yōu)化[D];延邊大學(xué);2013年

6 殷玉鵬;梅花鹿體細(xì)胞克隆胚胎構(gòu)建及Ercc6l基因表達(dá)的研究[D];吉林大學(xué);2012年

7 宋輝;山羊誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

8 吳俠;牛體外受精胚胎及克隆胚胎發(fā)育過(guò)程中組蛋白修飾表觀遺傳重編程的研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2008年

9 高國(guó)龍;牛體細(xì)胞克隆中供體和受體細(xì)胞制備及重構(gòu)胚構(gòu)建的影響因素研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

10 袁建龍;利用體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因絨山羊的研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2013年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 孫秀柱;魯西黃牛體細(xì)胞克隆保種技術(shù)的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2004年

2 張宇;延邊黃牛體細(xì)胞克隆早期胚胎端粒酶活性的研究[D];延邊大學(xué);2010年

3 羅學(xué)明;體細(xì)胞克隆繁育優(yōu)秀種公豬技術(shù)的研究[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

4 黃雷;轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆豬胚胎的制備[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2011年

5 劉佳麗;黑熊體細(xì)胞培養(yǎng)及熊—牛體細(xì)胞克隆胚胎融合條件初探[D];延邊大學(xué);2010年

6 陳會(huì)蘭;克隆豬部分組織病理學(xué)及生理生化指標(biāo)分析[D];上海海洋大學(xué);2012年

7 呂鑫;四倍體補(bǔ)償法提高牛體細(xì)胞克隆效率的研究[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

8 白力;去乙�；敢种苿￢PA對(duì)牛體細(xì)胞及克隆胚胎發(fā)育的影響[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2012年

9 周娜汝;豬體細(xì)胞克隆胚胎著床前發(fā)育期間H3K27乙�；鼐幊桃�(guī)律研究[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

10 王楠楠;曲古菌素A對(duì)延邊黃牛體細(xì)胞形態(tài)、增殖特性及核移植重構(gòu)胚胎的影響[D];延邊大學(xué);2012年

  本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良家畜的現(xiàn)狀與趨勢(shì)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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