本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良家畜的現(xiàn)狀與趨勢，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)》 2009年

體細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)ω-3脂肪酸去飽和酶基因豬

馮沖  

【摘要】： 豬肉是人類重要的動物性食品,豬肉中所含多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFAs)大部分為ω-6 PUFAs,而對人體健康有重要價值的ω-3 PUFAs含量較少。本研究利用體細(xì)胞核移植技術(shù)首次成功生產(chǎn)了轉(zhuǎn)ω-3脂肪酸去飽和酶基因(sFat-1)克隆豬,結(jié)果如下: 實驗一:采用組織塊培養(yǎng)法,建立了7個38日胎齡的純種英系大白豬胎兒成纖維細(xì)胞系;細(xì)胞接觸抑制2 d后,經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn), 80%以上的細(xì)胞處于G0/G1期。 實驗二:利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法,將sFat-1基因轉(zhuǎn)染至大白豬胎兒成纖維細(xì)胞,并對細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及篩選條件進(jìn)行了優(yōu)化。通過大白豬胎兒成纖維細(xì)胞對G418敏感性檢測發(fā)現(xiàn),600μg/mL的G418可以在7 d內(nèi)將細(xì)胞全部殺死,因此篩選時選擇該濃度較為合適。比較了脂質(zhì)體采用與DNA的比例分別為10μL : 3μg、10μL : 4μg、10μL : 6μg和10μL : 7μg時的轉(zhuǎn)染效率,其中脂質(zhì)體與DNA的比例控制在10μL:4μgm時,篩選后所得細(xì)胞克隆數(shù)最高(20個);對篩選出的G418抗性細(xì)胞克隆中狀態(tài)較好的18個進(jìn)行了PCR及RT-PCR檢測,PCR檢測結(jié)果顯示:18、3、6、12、16及17號克隆點細(xì)胞,為轉(zhuǎn)基因陰性細(xì)胞;再利用RT-PCR對剩余12個PCR陽性克隆點的細(xì)胞進(jìn)行RNA表達(dá)水平檢測,結(jié)果4號克隆點的RNA表達(dá)量極低,認(rèn)定其為轉(zhuǎn)基因陰性,其余11個為陽性。 實驗三:為了提高克隆胚胎的發(fā)育能力,將卵巢上的卵泡按直徑分為大卵泡(直徑4-6 mm)及小卵泡(直徑2-3 mm)兩組,體外成熟38 - 42 h后作為胞質(zhì)受體,以胚胎的卵裂率和囊胚率為檢驗標(biāo)準(zhǔn),評價卵泡大小及成熟時間(卵齡)對卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量的影響;胚胎輔助激活上,比較了胚胎輔助激活采用電激活和CHX化學(xué)激活對胚胎發(fā)育的影響。結(jié)果,卵齡40 h的大卵泡卵母細(xì)胞的囊胚發(fā)育率(19.3±1.7%,P 0.05)顯著高于其它各組,42 h的小卵泡卵母細(xì)胞的囊胚率次之(11.0±1.3%);CHX化學(xué)輔助激活能提高胚胎的囊胚率,并且能夠顯著提高小卵泡胚胎的囊胚發(fā)育率(P 0.05),但大卵泡組胚胎囊胚率未見顯著提高。實驗四:以鑒定為轉(zhuǎn)基因陽性的細(xì)胞為核供體,體外成熟的卵母細(xì)胞為胞質(zhì)受體構(gòu)建克隆胚胎,胚胎經(jīng)體外培養(yǎng)后進(jìn)行胚胎移植,共移植1889枚1-4細(xì)胞期克隆胚胎到10頭受體母豬的輸卵管內(nèi),28天B超檢測9頭受體母豬妊娠(90%),7頭妊娠足月(70%)分娩產(chǎn)下21頭仔豬,體細(xì)胞克隆豬的效率為1.1%(出生仔豬/移植胚胎)。對健康存活15頭克隆豬進(jìn)行了PCR和Southern檢測,證實13頭為轉(zhuǎn)基因豬,轉(zhuǎn)基因陽性率為87%。RT-PCR檢測13頭轉(zhuǎn)基因豬,12頭表達(dá)sFat-1基因。 上述結(jié)果表明,利用SCNT可以有效的生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬,并且通過對供體細(xì)胞的轉(zhuǎn)染、篩選及鑒定,可使轉(zhuǎn)基因效率達(dá)到較高水平。轉(zhuǎn)sFat-1基因克隆豬的誕生,為探索通過轉(zhuǎn)基因手段改善豬肉品質(zhì)奠定了堅實的基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：S828;Q819
【目錄】：

摘要6-8

Summary8-13

第一章 文獻(xiàn)綜述13-32

1 轉(zhuǎn)基因動物的制作與應(yīng)用14-18

1.1 動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究進(jìn)展14-16

1.2 動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用16-17

1.3 轉(zhuǎn)基因動物轉(zhuǎn)基因存在的問題17-18

2 動物體細(xì)胞克隆技術(shù)18-27

2.1 動物克隆研究的簡要回顧18

2.2 動物體細(xì)胞克隆技術(shù)的方法18-22

2.3 體細(xì)胞克隆豬及其應(yīng)用22-24

2.4 轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆技術(shù)24-25

2.5 動物克隆存在的問題25-27

3 多不飽和脂肪酸的功能及其基因工程研究進(jìn)展27-31

3.1 PUFAs 概述27

3.2 ω-3 和ω-6 多不飽和脂肪酸的生理功能27-28

3.3 ω-6 和ω-3PUFAs 的生物合成28-29

3.4 ω-3 PUFAs 的基因工程合成的研究進(jìn)展29-31

4 本研究的目的和意義31-32

4.1 研究目的31

4.2 研究意義31-32

第二章 試驗部分32-58

1 大白豬胎兒成纖維細(xì)胞系建立32-38

前言32

1.1 材料與方法32-35

1.2 結(jié)果35-37

1.3 討論37-38

2 sFat-1 基因轉(zhuǎn)染大白豬胎兒成纖維細(xì)胞的研究38-44

前言38

2.1 材料與方法38-40

2.2 結(jié)果與分析40-42

2.3 討論42-44

3 卵泡直徑及輔助激活方式對克隆胚胎發(fā)育能力的影響44-52

前言44-45

3.1 材料與方法45-48

3.2 試驗設(shè)計48

3.3 結(jié)果48-50

3.4 討論50-52

4 轉(zhuǎn)ω-3 脂肪酸去飽和酶基因sFat-1 克隆豬的生產(chǎn)52-58

前言52-53

4.1 材料與方法53-54

4.2 結(jié)果54-56

4.3 討論56-58

第三章 結(jié)論58-59

參考文獻(xiàn)59-65

致謝65-66

導(dǎo)師簡介66-68

作者簡歷68

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4 ;我國首個體細(xì)胞克隆牛胚胎移植中心成立[J];生物學(xué)通報;2004年09期

5 李擁軍,薛慧文;哺乳動物體細(xì)胞克隆的研究與應(yīng)用[J];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;2003年03期

6 張德福;劉東;吳華麗;陳學(xué)進(jìn);王凱;陳瑩;;豬作為異種器官移植供體的研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢[J];豬業(yè)科學(xué);2006年07期

7 ;中國克隆豬[J];青島畫報;2007年02期

8 ;世界首批亞種間體細(xì)胞克隆羊試驗在上海獲成功[J];當(dāng)代畜牧;2005年12期

9 ;日本成功克隆已故"名牛"[J];畜牧獸醫(yī)科技信息;2009年01期

10 ;轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆奶山羊成功[J];湖南畜牧獸醫(yī);2002年06期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 黃永業(yè);譚廣云;謝萬華;周炎;李棟;賴良學(xué);逄大欣;歐陽紅生;;規(guī)�；w細(xì)胞克隆豬生產(chǎn)的探討[A];全國動物生理生化第十一次學(xué)術(shù)交流會論文摘要匯編[C];2010年

2 朱姿英;楊小淦;盧晟盛;陸陽清;盧克煥;;豬體細(xì)胞克隆安全性評估及其產(chǎn)業(yè)化研究進(jìn)展—以牛體細(xì)胞克隆產(chǎn)業(yè)化為鑒[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物繁殖學(xué)分會第十五屆學(xué)術(shù)研討會論文集（上冊）[C];2010年

3 王曉麗;蔣建榮;徐莉萍;房慧伶;辛立江;石德順;;一例體細(xì)胞克隆水牛肺、脾臟的組織結(jié)構(gòu)觀察[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物解剖學(xué)及組織胚胎學(xué)分會第十六次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2010年

4 宋少康;董雅娟;柏學(xué)進(jìn);牛召珊;朱孟芝;;體細(xì)胞克隆在肉牛育種上的研究進(jìn)展及展望[A];2010中國牛業(yè)進(jìn)展[C];2010年

5 張運海;劉亞;王維;陶勇;章孝榮;;體細(xì)胞克隆技術(shù)與安徽奶牛良種化[A];現(xiàn)代農(nóng)業(yè)理論與實踐——安徽現(xiàn)代農(nóng)業(yè)博士科技論壇論文集[C];2007年

6 劉麗梅;高飛;張鵬;安培培;宋光啟;湯黎娜;唐博;李子義;;丁酸鈉對豬體細(xì)胞克隆胚胎重編程及組蛋白乙酰化的影響[A];“細(xì)胞活動 生命活力”——中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會全體會員代表大會暨第十二次學(xué)術(shù)大會論文摘要集[C];2011年

7 雷安民;敬曉棋;嚴(yán)興榮;胥濤;竇忠英;;體細(xì)胞克隆胚胎形態(tài)與質(zhì)量相關(guān)性的研究[A];全國首屆動物生物技術(shù)學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2004年

8 胡軍和;楊春榮;雷安民;敬曉棋;竇忠英;;體細(xì)胞克隆豬的研究進(jìn)展(英文)[A];全國首屆動物生物技術(shù)學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2004年

9 茍克勉;安曉榮;陳永福;;體細(xì)胞克隆法生產(chǎn)綿羊轉(zhuǎn)基因囊胚[A];中國生物工程學(xué)會第三次全國會員代表大會暨學(xué)術(shù)討論會論文摘要集[C];2001年

10 劉鳳軍;王秀愛;莊益芬;葉屹峰;余翠月;洪志勇;陳梅芳;陳曦;謝旭東;張文昌;;微電極融合法對豬體細(xì)胞克隆胚胎融合激活及胚胎發(fā)育的影響[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物繁殖學(xué)分會第十五屆學(xué)術(shù)研討會論文集（上冊）[C];2010年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王柏濤　于永生 記者 于寧;[N];吉林日報;2011年

2 通訊員 樂良 成修 記者 詩星 野軍;[N];煙臺日報;2009年

3 林樂良　記者 操秀英;[N];科技日報;2009年

4 記者 王世煥;[N];新華每日電訊;2000年

5 周華、王立芳;[N];人民日報海外版;2005年

6 通訊員紀(jì)和春記者王建高;[N];科技日報;2002年

7 記者 張可喜;[N];新華每日電訊;2002年

8 本報記者 操秀英;[N];科技日報;2009年

9 記者　趙秋麗　特約記者　李志臣;[N];光明日報;2003年

10 記者范建通訊員才杰;[N];科技日報;2002年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 蘇建民;牛體細(xì)胞克隆中異常重編程的分析及提高重編程效率的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2012年

2 楊月春;延邊黃牛體細(xì)胞克隆胚胎氧化損傷的研究[D];延邊大學(xué);2010年

3 朱化彬;奶牛體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)的研究[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

4 屈婭;基于細(xì)胞電融合技術(shù)的體細(xì)胞重編程研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2012年

5 柳海星;轉(zhuǎn)人血清白蛋白延邊奶山羊—綿羊體細(xì)胞克隆胚胎生產(chǎn)體系的優(yōu)化[D];延邊大學(xué);2013年

6 殷玉鵬;梅花鹿體細(xì)胞克隆胚胎構(gòu)建及Ercc6l基因表達(dá)的研究[D];吉林大學(xué);2012年

7 宋輝;山羊誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

8 吳俠;牛體外受精胚胎及克隆胚胎發(fā)育過程中組蛋白修飾表觀遺傳重編程的研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2008年

9 高國龍;牛體細(xì)胞克隆中供體和受體細(xì)胞制備及重構(gòu)胚構(gòu)建的影響因素研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

10 袁建龍;利用體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因絨山羊的研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2013年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 孫秀柱;魯西黃牛體細(xì)胞克隆保種技術(shù)的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2004年

2 張宇;延邊黃牛體細(xì)胞克隆早期胚胎端粒酶活性的研究[D];延邊大學(xué);2010年

3 羅學(xué)明;體細(xì)胞克隆繁育優(yōu)秀種公豬技術(shù)的研究[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

4 黃雷;轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞克隆豬胚胎的制備[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2011年

5 劉佳麗;黑熊體細(xì)胞培養(yǎng)及熊—牛體細(xì)胞克隆胚胎融合條件初探[D];延邊大學(xué);2010年

6 陳會蘭;克隆豬部分組織病理學(xué)及生理生化指標(biāo)分析[D];上海海洋大學(xué);2012年

7 呂鑫;四倍體補償法提高牛體細(xì)胞克隆效率的研究[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

8 白力;去乙�；敢种苿￢PA對牛體細(xì)胞及克隆胚胎發(fā)育的影響[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2012年

9 周娜汝;豬體細(xì)胞克隆胚胎著床前發(fā)育期間H3K27乙�；鼐幊桃�(guī)律研究[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

10 王楠楠;曲古菌素A對延邊黃牛體細(xì)胞形態(tài)、增殖特性及核移植重構(gòu)胚胎的影響[D];延邊大學(xué);2012年

  本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良家畜的現(xiàn)狀與趨勢，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：111433