發(fā)布時(shí)間：2017-10-29 13:06

  本文關(guān)鍵詞：油菜黃籽基因的克隆、表達(dá)及分子標(biāo)記的應(yīng)用

  更多相關(guān)文章： 油菜 TT6 TT5 克隆 表達(dá)分析 分子標(biāo)記

【摘要】：黃籽油菜較褐籽油菜具有含油量高、蛋白質(zhì)含量高、種皮薄、皮殼率低、纖維素含量低等優(yōu)點(diǎn),因此黃籽性狀在油菜育種中倍受關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)室對油菜黃籽性狀進(jìn)行了多年的研究,已經(jīng)精細(xì)定位芥菜型油菜陜北黃芥的黃籽基因于白菜A09染色體上,其同源區(qū)域位于擬南芥的第3染色體上。擬南芥種皮色突變基因TT6與TT5基因位于擬南芥第3染色體上,因此推測TT6與TT5基因?yàn)榻娌诵陀筒岁儽秉S芥的黃籽候選基因。本研究以TT6、TT5基因?yàn)辄S籽候選基因,在三大類型油菜不同黃、褐籽材料中克隆這兩個(gè)基因,比較分析三大類型油菜中兩基因的序列及結(jié)構(gòu)差異,應(yīng)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測分析該基因的開放閱讀框(ORF),上下游非編碼區(qū),基因編碼的氨基酸序列,探討黃色種皮形成的分子機(jī)制,為油菜黃籽轉(zhuǎn)基因育種奠定基礎(chǔ)。分析TT6、TT5兩基因在芥菜型油菜(吳旗黃芥和武功芥菜)中不同組織、不同發(fā)育時(shí)期種子中的表達(dá)情況,進(jìn)一步確定TT6、TT5對油菜黃色種皮形成的作用。本研究取得主要結(jié)果如下:1.芥菜型油菜TT6、TT5基因的克隆和序列分析分別在吳旗黃芥和武功芥菜的gDNA和cDNA中克隆TT6、TT5基因,結(jié)果如下:(1)在吳旗黃芥和武功芥菜的gDNA中,克隆TT6基因分別命名為BjTT6-y1和BjTT6-b1,其編碼區(qū)長分別是1457bp和1513bp;克隆TT5基因,分別命名為BjTT5-y1和BjTT5-b1,其編碼區(qū)長分別是1621bp和1623bp。(2)序列分析表明吳旗黃芥和武功芥菜TT6基因均含有三個(gè)外顯子和兩個(gè)內(nèi)含子,BjTT6-b1的序列與白菜型油菜Bra036828完全一致;吳旗黃芥和武功芥菜TT6基因ORF長1077bp,編碼358個(gè)氨基酸;但是BjTT6-b1和BjTT6-y1的cDNA序列的之間有7個(gè)單核苷酸位點(diǎn)的差異,其中第760位核苷酸在武功芥菜中為T、吳旗黃芥中為G,導(dǎo)致了第254位氨基酸的差異,武功芥菜中為纈氨酸(V),吳旗黃芥中為苯丙氨酸(F)。(3)吳旗黃芥和武功芥菜TT5基因均含有四個(gè)外顯子和三個(gè)內(nèi)含子,與Bra007142基因結(jié)構(gòu)一致;BjTT5-y1與BjTT5-b1.1序列完全相同,BjTT5-y1和BjTT5-b1.1的ORF均為759bp,編碼252個(gè)氨基酸;Bj TT5-b1.1和BjTT5-b1.2兩序列存在4個(gè)單堿基差異,第346位核苷酸的差異(G/T),使終止密碼子提前出現(xiàn)造成翻譯的提前終止,從而使BjTT5-b1.2的ORF為348bp,編碼115個(gè)氨基酸,造成蛋白結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)等方面的差異。2、三大類型油菜tt6、tt5基因的序列分析在芥菜型油菜、白菜型油菜、甘藍(lán)型油菜三大類型中不同黃、褐籽品系中克隆這兩個(gè)基因,比較分析三大類型油菜中tt6、tt5基因的序列差異。結(jié)果如下:(1)tt6基因序列在三大類型油菜中一致的差異位點(diǎn)有2個(gè),分別是第510、897位。第510位點(diǎn)上甘藍(lán)型油菜褐籽材料均為a,白菜油菜褐籽材料均為g;第897位點(diǎn)上芥菜型油菜黃籽材料和白菜油菜褐籽材料均為c,但是這兩個(gè)位點(diǎn)的堿基差異都不造成氨基酸的改變。白菜型油菜第510、760、834位,甘藍(lán)型油菜第30、126、378位與芥菜型油菜中的單核苷酸的差異位點(diǎn)相同,其中在760位核苷酸的差異造成氨基酸的改變。此外,tt6基因在三大類型油菜中芥菜型型油菜中同源性最高,其次是白菜型油菜,甘藍(lán)型油菜中同源性最低。(2)tt5基因序列在三大類型油菜中一致的差異位點(diǎn)有2個(gè),分別是第202、345位。這兩個(gè)位點(diǎn)上白菜型油菜的黃籽材料堿基一致分別是a、g,芥菜型油菜褐籽材料的堿基一致分別是c、a,而且第202位的堿基差異(a/c)會(huì)造成氨基酸的改變(蘇氨酸t(yī)/脯氨酸p)。此外,tt5基因在三大類型油菜中白菜型油菜中同源性最高,其次是甘藍(lán)型油菜,芥菜型油菜中同源性較低。3、系統(tǒng)進(jìn)化分析經(jīng)序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化分析,結(jié)果如下:(1)油菜中tt6與其他物種距離由近到遠(yuǎn)依次是擬南芥、玉米和葡萄、番茄、大豆;芥菜型油菜與白菜型油菜tt6距離較近說明芥菜型黃、褐籽基因可能來源于白菜型黃、褐籽材料;甘藍(lán)型油菜不同黃、褐籽材料的tt6基因分布較復(fù)雜,不能確定其來源。(2)油菜中tt5與其他物種距離由近到遠(yuǎn)依次是甘藍(lán)、水稻、擬南芥、葡萄、甜橙、大豆和綠豆。白菜型油菜與甘藍(lán)型油菜距離較近,甘藍(lán)型油菜褐籽基因分布集中,且與brb2-tt5距離最近,推測甘藍(lán)型油菜褐籽基因可能來源于brb2(涇陽油菜)這一褐籽材料。4、表達(dá)分析吳旗黃芥和武功芥菜bjtt6和bjtt5基因不同組織、不同發(fā)育時(shí)期種子的表達(dá)分析,結(jié)果如下:(1)bjtt6在吳旗黃芥和武功芥菜的初花期的葉片、花蕾、花,角果皮,不同時(shí)期種子中均有表達(dá),但表達(dá)量具有明顯的組織特異性,且吳旗黃芥和武功芥菜特異性表現(xiàn)不一致。吳旗黃芥花蕾中表達(dá)水平最高(89.216),其次是23dap種子(40.078),葉片中表達(dá)水平最低(1.325);武功芥菜9dap種子中表達(dá)水平最高(176.013),其次是16dap種子(87.862),角果皮中表達(dá)水平最低(2.116)。武功芥菜bjtt6在分別葉片、9dap、16dap種子中表達(dá)量顯著高于吳旗黃芥相同組織,吳旗黃芥bjtt6在花蕾、花、23dap種子、30dap種子中表達(dá)量顯著高于武功芥菜相同組織。(2)bjtt6在吳旗黃芥和武功芥菜種子發(fā)育期前期表達(dá)水平均高于種子發(fā)育后期;武功芥菜BjTT6表達(dá)量在種子發(fā)育中前期隨種子發(fā)育迅速由峰值(176.013)降低至最小值23DAP(2.435),此后隨種子成熟略有增加;吳旗黃芥BjTT6表達(dá)量在種子發(fā)育中前期隨種子發(fā)育略有增加,表達(dá)量在23DAP時(shí)期達(dá)到峰值(40.078),此后逐漸降低至45DAP最小值(3.255)。(3)Bj TT5在吳旗黃芥初花期的的葉片,花蕾,花、角果皮、不同時(shí)期種子中表達(dá)量均較低且無明顯的組織特異性;BjTT5在武功芥菜初花期的的葉片、花蕾、花、角果皮、不同時(shí)期種子中均有表達(dá)且表達(dá)量具有明顯的組織特異性,武功芥菜中花蕾表達(dá)水平最高(6.922),其次是花(1.620),9DAP種子中表達(dá)水平最低(0.095)。(4)BjTT5在吳旗黃芥和武功芥菜在種子發(fā)育期前期的表達(dá)水平均低于種子發(fā)育中后期;在種子發(fā)育前期吳旗黃芥中BjTT5表達(dá)量略高于武功芥菜同一時(shí)期的表達(dá)量,種子發(fā)育中后期吳旗黃芥中BjTT5表達(dá)量均低于武功芥菜同一時(shí)期的表達(dá)量。武功芥菜BjTT5表達(dá)量在種子發(fā)育前期隨種子發(fā)育迅速升高至峰值(1.123),此后隨種子成熟表達(dá)量基本穩(wěn)定;吳旗黃芥BjTT5種子發(fā)育的整個(gè)時(shí)期表達(dá)水平均較低,吳旗黃芥BjTT5表達(dá)量在種子發(fā)育前中期隨種子發(fā)育逐漸增加,表達(dá)量在30DAP時(shí)期達(dá)到峰值(0.678),此后隨種子成熟表達(dá)量逐漸降低。(5)BjTT5在種子形成發(fā)育后期表達(dá)量較前期高,說明BjTT5可能在種子發(fā)育后期類黃酮途徑起作用,但是在整個(gè)種子發(fā)育期,BjTT5基因的表達(dá)水平均不高。BjTT6在種子形成發(fā)育前期表達(dá)量較后期高,說明BjTT6可能在種子發(fā)育前期類黃酮途徑起作用。此外在種子形成前期吳旗黃芥與武功芥菜BjTT6的表達(dá)量存在明顯的差異,故推斷芥菜型油菜BjTT6與油菜種子黃、褐籽的性狀形成有關(guān)。5、黃籽標(biāo)記的開發(fā)根據(jù)本研究克隆獲得的BjTT6-y1與BjTT6-b1基因組DNA第一個(gè)內(nèi)含子內(nèi)部存在的55 bp片段的缺失信息,開發(fā)了一個(gè)芥菜型油菜種皮色基因TT6特異性的共顯性IP標(biāo)記。6、SSR標(biāo)記在種子純度鑒定中的應(yīng)用本研究利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對甘藍(lán)型油菜雜交種陜油16及其雙親進(jìn)行了引物篩選和純度鑒定研究獲得3對引物SSR313、SSR354、SSR359,均表現(xiàn)共顯性并利用這3對引物對陜油16雜交種進(jìn)行純度鑒定。
【關(guān)鍵詞】：油菜 TT6 TT5 克隆 表達(dá)分析 分子標(biāo)記
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S565.4
【目錄】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-14
• 第一章 文獻(xiàn)綜述14-25
• 1.1 油菜黃籽性狀的遺傳研究15
• 1.2 油菜黃籽基因的定位研究15-16
• 1.3 種皮色相關(guān)基因及克隆16-21
• 1.3.1 結(jié)構(gòu)基因17-19
• 1.3.2 調(diào)控基因19-20
• 1.3.3 其他相關(guān)基因20-21
• 1.4 種皮色相關(guān)基因的表達(dá)分析21-22
• 1.4.1 油菜及近緣植物種皮色相關(guān)基因的表達(dá)分析21-22
• 1.4.2 其他植物種皮色相關(guān)基因的表達(dá)分析22
• 1.5 種皮結(jié)構(gòu)及色素的研究22-23
• 1.6 本研究的目的及意義23-24
• 1.7 技術(shù)路線24-25
• 1.7.1 基因克隆24
• 1.7.2 表達(dá)分析24-25
• 第二章 芥菜型油菜TT6和TT5基因的克隆與分析25-51
• 2.1 試驗(yàn)材料與方法25-30
• 2.1.1 植物材料25-26
• 2.1.2 試驗(yàn)試劑及儀器26
• 2.1.3 載體與菌株26-27
• 2.1.4 油菜TT6和TT5基因序列的克隆27-30
• 2.1.5 油菜TT6和TT5基因序列分析30
• 2.1.6 油菜TT6和TT5基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測30
• 2.1.7 系統(tǒng)進(jìn)化分析30
• 2.2 結(jié)果與分析30-48
• 2.2.1 不同種皮色芥菜型油菜TT6基因gDNA序列的克隆及序列分析30-35
• 2.2.2 不同種皮色芥菜型油菜TT5基因gDNA序列的克隆及序列分析35-36
• 2.2.3 不同種皮色芥菜型油菜TT6基因cDNA序列的克隆及序列分析36-42
• 2.2.4 不同種皮色芥菜型油菜TT5基因cDNA序列的克隆及序列分析42-47
• 2.2.5 芥菜型油菜TT6基因特有IP標(biāo)記的開發(fā)47-48
• 2.3 討論48-51
• 2.3.1 不同種皮色芥菜型油菜TT6基因的差異分析48
• 2.3.2 不同種皮色芥菜型油菜TT5基因的差異分析48-49
• 2.3.3 油菜TT6、TT5基因來源及系統(tǒng)進(jìn)化分析49
• 2.3.4 芥菜型油菜TT6基因上游啟動(dòng)子區(qū)域分析預(yù)測49
• 2.3.5 芥菜型油菜TT6基因ploy（A）信號序列分析預(yù)測49-50
• 2.3.6 芥菜型油菜TT6基因特有IP標(biāo)記的開發(fā)50-51
• 第三章 芥菜型油菜TT6和TT5基因的表達(dá)分析51-58
• 3.1 試驗(yàn)材料與方法51-53
• 3.1.1 植物材料和取樣方法51
• 3.1.2 試驗(yàn)試劑及儀器51
• 3.1.3 Real Time PCR操作步驟51-53
• 3.2 結(jié)果與分析53-56
• 3.2.1 BjTT6基因的表達(dá)分析53-54
• 3.2.2 BjTT5基因的表達(dá)分析54-56
• 3.3 討論56-58
• 3.3.1 TT6、TT5基因表達(dá)的特異性56
• 3.3.2 TT6、TT5基因與種皮色的關(guān)系56-58
• 第四章 SSR標(biāo)記在種子純度鑒定中的應(yīng)用58-62
• 4.1 試驗(yàn)材料與方法58-59
• 4.1.1 植物材料58
• 4.1.2 試驗(yàn)試劑及儀器58
• 4.1.3 引物合成58-59
• 4.2 結(jié)果與分析59-61
• 4.2.1 特征型引物的篩選59
• 4.2.2 SSR標(biāo)記用于種子純度鑒定59-61
• 4.2.3 田間植株鑒定61
• 4.3 討論61-62
• 第五章 全文結(jié)論62-64
• 5.1 芥菜型油菜TT6和TT5基因的克隆及序列分析62
• 5.2 芥菜型油菜TT6和TT5基因的表達(dá)分析62-63
• 5.3 芥菜型油菜黃籽基因IP標(biāo)記的開發(fā)63
• 5.4 SSR標(biāo)記在甘藍(lán)型油菜雜交種純度鑒定中的應(yīng)用63-64
• 參考文獻(xiàn)64-74
• 附錄 174-75
• 附錄 275-76
• 附錄 376-78
• 附錄 478-82
• 致謝82-83
• 作者簡介83

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