本文關(guān)鍵詞：玉米脆稈突變體基因初定位及芒草農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因體系初探

  更多相關(guān)文章： 脆稈突變體 Mutator轉(zhuǎn)座子 細(xì)胞壁 纖維素 機(jī)械強(qiáng)度 芒草 愈傷 農(nóng)桿菌介導(dǎo) 遺傳轉(zhuǎn)化

【摘要】：玉米秸稈不僅作為生物質(zhì)能源的重要原材料,在飼料以及其他生物與工業(yè)產(chǎn)品中也占有極其重要的地位。脆稈突變體是研究細(xì)胞壁形成機(jī)制以及對細(xì)胞壁改良的重要資源。本實(shí)驗(yàn)自交系Zong31和帶有Mu轉(zhuǎn)座活性的自交系W22交雜構(gòu)建的突變體庫中,篩選得到了莖稈和葉片都明顯表現(xiàn)為脆性的突變體植株,命名為Y04,經(jīng)多代自交和表型的鑒定,獲得了穩(wěn)定的純合突變體。本研究應(yīng)用形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、和遺傳學(xué)等方法分析了此突變體與正常玉米的莖稈穿刺力、成熟期生物學(xué)性狀的測定、成熟期莖稈的顯微結(jié)構(gòu)、秸稈細(xì)胞壁成分的差異、纖維素影響因子的測定,并將引起脆性表型的基因br(brittle stalk)進(jìn)行了初步定位。為今后深入研究脆性基因的克隆、功能的分析以及生物質(zhì)能源利用等提供了材料和理論基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:1)田間表型觀測:在種子萌發(fā)和幼苗階段,突變體和正常玉米植株生長情況并無差異。在突變體生長約至4周即四葉一心期時(shí),開始出現(xiàn)脆性,所有器官均表現(xiàn)為脆性,且整個(gè)生育期持續(xù)存在。2)突變體的莖稈與Zong31相比,組織韌性和穿刺力強(qiáng)度減弱,極其容易被折斷。莖稈穿刺力測定結(jié)果表明:脆性植株莖稈的穿刺力較Zong31和Mu有極顯著降低,分別降低了46.1%和68.5%。3)徒手切片染色結(jié)果顯示:脆性植株莖稈維管束數(shù)目、分布及皮層周圍細(xì)胞層數(shù)與正常植株差異不大。主要是維管束細(xì)胞的纖維素含量降低,木質(zhì)素含量升高。掃描電鏡觀測顯示:突變體維管束鞘細(xì)胞厚壁組織細(xì)胞壁厚度明顯變薄,排列疏松。4)莖稈細(xì)胞壁化學(xué)成分測定的結(jié)果表明:脆稈突變體中,纖維素含量占干物質(zhì)總量的12.77%,極顯著低于正常植物的31.2%;纖維素結(jié)晶度極顯著低于Zong31的21.5%;淀粉含量占干物質(zhì)總量的0.75%,顯著性低于Zong31的24.2%;可溶性糖含量占干物質(zhì)總量的33.56%,顯著性高于Zong31的18.6%。半纖維素略有下降,木質(zhì)素和果膠含量略有升高,均較對照差異不明顯。5)Y04脆性基因br(brittle stalk)克隆結(jié)果顯示與bk2并不相同,在Zong31背景下較br與bk2有多處單堿基缺失,在1472-1557之間有幾處較大缺失,對缺失片段進(jìn)行群體檢測發(fā)現(xiàn)并不是由此缺失引起表型的改變。6)2013年秋天在武漢實(shí)驗(yàn)基地種植的F1單株,田間表型正常;2015年春天漢川實(shí)驗(yàn)基地種植的約1500株單株F2群體中正常和脆性植株的分離比為1150:244,損失脆稈約為106株,符合3:1分離比。圖位克隆方法將br基因定位在9號染色體上,鎖定在bnlg1159和umc1771之間,且br與umc1120和umc2121共分離,目標(biāo)基因br距離umc2398和umc1771最近,遺傳距離分別是11.5c M和3.1c M,說明目標(biāo)基因br更靠近umc1771標(biāo)記。芒(Miscanthus sinensis)是自然界中分布最為廣泛的芒屬物種,它是目前國際上研究最為熱門的三倍體交雜種芒草-巨芒(M.×giganteus)其中的二倍體親本,是開展遺傳改良的遺傳種質(zhì)基礎(chǔ)。新品種的選育是大面積種植和利用芒屬能源植物需要解決的首要問題,遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是進(jìn)行遺傳改良最有效的途徑之一,其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化以其成本低、轉(zhuǎn)化效率高、易操作等優(yōu)勢被廣泛的應(yīng)用到外源基因?qū)氲绞荏w細(xì)胞的過程中去。本研究以芒的幼穗作為外植體誘導(dǎo)胚性愈傷作為受體材料,研究了以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法為基礎(chǔ),活性炭,農(nóng)桿菌菌液濃度,乙酰丁香酮濃度的差異,表面活性劑,超聲波處理等對轉(zhuǎn)化效率的影響。其主要的結(jié)果如下:1)在誘導(dǎo)15天的培養(yǎng)過程中,沒有添加活性炭(AC)的培養(yǎng)基褐化嚴(yán)重;在添加了0.2%AC的培養(yǎng)基中,褐化并不明顯。2)統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)80天后,愈傷在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的生長狀態(tài),沒有添加活性炭的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出愈傷較添加了0.2%活性炭的培養(yǎng)基要多。沒有添加活性炭(AC)培養(yǎng)基的出愈率為79.0%,而添加了0.2%AC的培養(yǎng)基的出愈率為38.9%。3)不同農(nóng)桿菌菌液OD600和時(shí)間組合侵染胚性愈傷,并將轉(zhuǎn)化后的愈傷分別經(jīng)過第一次選擇和第二次選擇后,只有OD600=0.7,侵染30min這個(gè)組合下的愈傷,在經(jīng)過兩次篩選后有存活下來的愈傷。故農(nóng)桿菌菌液OD600=0.7,侵染30min為最佳組合。4)超聲波在農(nóng)桿菌侵染愈傷過程中的處理,在侵染過程中利用超聲波分別處理0、2、4、8、300、600、1200s后,將愈傷接種到一選培養(yǎng)基上,0、2、4、8s處理過的愈傷均全部死亡,而經(jīng)過300、600、1200s超聲處理過后的愈傷在經(jīng)過二選后,幾乎全部存活下來,說明,較長時(shí)間超聲波處理對愈傷的轉(zhuǎn)化的提高有顯著作用。
【關(guān)鍵詞】：脆稈突變體 Mutator轉(zhuǎn)座子 細(xì)胞壁 纖維素 機(jī)械強(qiáng)度 芒草 愈傷 農(nóng)桿菌介導(dǎo) 遺傳轉(zhuǎn)化
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S513
【目錄】：

• 第一章 玉米脆稈突變體基因初定位7-48
• 摘要7-9
• Abstract9-10
• 縮寫名詞表10-11
• 1 文獻(xiàn)綜述11-18
• 1.1 植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)11-13
• 1.2 脆稈性狀研究進(jìn)展13-14
• 1.3 COBRA研究進(jìn)展14-15
• 1.4 影響三大成分降解轉(zhuǎn)化因子的研究進(jìn)展15-17
• 1.5 研究的目的和意義17-18
• 2 材料與方法18-31
• 2.1 材料來源18
• 2.2 遺傳群體的構(gòu)建、田間性狀的考察18
• 2.3 主要使用儀器和試劑18-19
• 2.4 植株葉片DNA的提取19
• 2.5 葉片脆性考察19
• 2.6 其他生物形狀考察19-20
• 2.7 葉脈、莖稈組織的顯微學(xué)觀察20
• 2.8 脆性基因的克隆20-24
• 2.8.1 引物設(shè)計(jì)20-21
• 2.8.2 PCR體系21
• 2.8.3 PCR產(chǎn)物的回收21-22
• 2.8.4 TA克隆22
• 2.8.5 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化22-23
• 2.8.6 菌落PCR23-24
• 2.8.7 質(zhì)粒DNA的提取24
• 2.9 成熟植株秸稈三大成分與產(chǎn)糖24-28
• 2.9.1 生物質(zhì)稀酸預(yù)處理及酶解24-25
• 2.9.2 生物質(zhì)稀堿預(yù)處理及酶解25
• 2.9.3 細(xì)胞壁多糖成分提取和測定25-26
• 2.9.4 細(xì)胞壁木質(zhì)素含量測定26-27
• 2.9.5 比色法測定六碳糖和五碳糖27
• 2.9.7 纖維素Cr I測定27-28
• 2.9.8 掃描電鏡觀察28
• 2.10 圖位克隆粗定位、精細(xì)定位28-31
• 2.10.1 試劑和儀器28-29
• 2.10.2 SSR標(biāo)記PCR體系和擴(kuò)增29
• 2.10.3 聚丙烯酰胺凝膠的制作及電泳29-31
• 3 結(jié)果與分析31-46
• 3.1 脆桿突變體的形態(tài)觀察31-32
• 3.2 脆性考察32-33
• 3.3 生物學(xué)性狀考察33-34
• 3.4 脆桿突變體莖稈組織掃描電鏡觀察34-37
• 3.5 莖稈細(xì)胞壁成分測定37-39
• 3.6 成熟期秸稈降解轉(zhuǎn)化效率測定39-41
• 3.7 Zong31、突變體Y04在bk2區(qū)域的擴(kuò)增41-43
• 3.8 脆桿突變體Y04基因bk圖位克隆43-46
• 4 討論與展望46-48
• 第二章 芒草農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因體系初探48-72
• 摘要48-49
• Abstract49-50
• 縮寫名詞表50-51
• 1 論文綜述51-57
• 1.1 芒草的種類、分布、產(chǎn)量、作為能源作物的特殊性51
• 1.2 農(nóng)桿菌在單子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展51-54
• 1.2.1 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的機(jī)理與特點(diǎn)51-52
• 1.2.2 影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)單子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化的因素52-54
• 1.3 芒草組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展54-55
• 1.4 基因槍轟擊轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展55-57
• 1.4.1 基因槍轉(zhuǎn)化的基本原理和特點(diǎn)56
• 1.4.2 影響基因槍轉(zhuǎn)化的因素56-57
• 2 材料和方法57-63
• 2.1 材料57-58
• 2.1.1 植物材料57
• 2.1.2 菌株與質(zhì)粒57
• 2.1.3 培養(yǎng)基配方57-58
• 2.2 試驗(yàn)方法58-63
• 2.2.1 愈傷組織的準(zhǔn)備58-59
• 2.2.2 農(nóng)桿菌活化培養(yǎng)59
• 2.2.3 農(nóng)桿菌侵染59-60
• 2.2.4 選擇培養(yǎng)60
• 2.2.5 分化培養(yǎng)及生根培養(yǎng)60
• 2.2.6 基因槍轟擊轉(zhuǎn)化法60-63
• 3 結(jié)果與分析63-69
• 3.1 活性炭對芒W70、W89誘導(dǎo)愈傷率的影響63-64
• 3.2 菌液濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響64-66
• 3.3 侵染液中乙酰丁香酮濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響66-67
• 3.4 侵染過程中表面活性劑TWEEN-20、silwet L-77 對轉(zhuǎn)化效率的影響67-68
• 3.5 超聲波處理對轉(zhuǎn)化效率的影響68
• 3.6 基因槍方法68-69
• 4.討論69-72
• 參考文獻(xiàn)72-82
• 附錄 182-85
• 附錄 285-88
• 個(gè)人簡歷88-89
• 致謝89-90

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王昌濤;趙玉錦;李坤遠(yuǎn);張世煌;;農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米萌動胚遺傳轉(zhuǎn)化新體系的建立[J];華北農(nóng)學(xué)報(bào);2007年05期

2 郭敏亮;;農(nóng)桿菌T-復(fù)合物招募蛋白的發(fā)現(xiàn)和生物學(xué)功能鑒定[J];江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2010年05期

3 楊明,黃興奇,張紹松,萬萌,鄢波;將重組質(zhì)粒高效導(dǎo)入農(nóng)桿菌的電脈沖轉(zhuǎn)化研究[J];西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2000年02期

4 王秀芹;劉希桂;曲建平;高建強(qiáng);王洪剛;;農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2006年18期

5 楊敏生;米丹;D.Ewald;王穎;梁海永;甄志先;;轉(zhuǎn)抗蟲基因三倍體毛白楊植株體內(nèi)農(nóng)桿菌殘存與逃逸[J];生態(tài)學(xué)報(bào);2006年11期

6 何道一,李中存,王洪剛;農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥活體轉(zhuǎn)化[J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);2003年12期

7 張傳義;曹秋芬;周慧;孟玉平;孫海峰;王卉;;抗生素對菊花葉片再生及農(nóng)桿菌生長的影響[J];生物技術(shù)通報(bào);2007年03期

8 鄧向陽;;農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展[J];基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué);2010年04期

9 于翠梅;劉限;馬蓮菊;張寶石;;影響農(nóng)桿菌滲入法瞬間表達(dá)重組蛋白系統(tǒng)的若干因素[J];生物技術(shù)通報(bào);2007年01期

10 劉德璞;袁英;郝文媛;王景會;李曉輝;孔祥梅;姜志磊;孫傳波;曲文利;;農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米合子基因轉(zhuǎn)化[J];分子植物育種;2008年05期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王昌濤;趙琦;楊愛國;趙玉錦;張世煌;;農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米萌動胚遺傳轉(zhuǎn)化新體系的建立[A];2004全國玉米種質(zhì)擴(kuò)增、改良、創(chuàng)新與分子育種學(xué)術(shù)會議論文集[C];2004年

2 黃玉吉;賴鐘雄;;農(nóng)桿菌介導(dǎo)的果樹遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展[A];福建省科協(xié)第五屆學(xué)術(shù)年會提高海峽西岸經(jīng)濟(jì)區(qū)農(nóng)業(yè)綜合生產(chǎn)能力分會場論文集[C];2005年

3 呂素蓮;張舉仁;李汝忠;;農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花莖尖遺傳轉(zhuǎn)化[A];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會第八屆會員代表大會暨學(xué)術(shù)大會論文摘要集[C];2003年

4 王艷麗;葉興國;杜麗璞;徐惠君;;農(nóng)桿菌敏感小麥基因型的篩選研究[A];科技、工程與經(jīng)濟(jì)社會協(xié)調(diào)發(fā)展——中國科協(xié)第五屆青年學(xué)術(shù)年會論文集[C];2004年

5 沈顯華;蔡耀輝;毛凌華;;農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化技術(shù)體系改良新進(jìn)展[A];湖北省遺傳學(xué)會、江西省遺傳學(xué)會2006年學(xué)術(shù)年會暨學(xué)術(shù)討論會論文摘要集[C];2006年

6 張興國;楊正安;李貞霞;蘇成剛;劉佩瑛;;農(nóng)桿菌介導(dǎo)的魔芋轉(zhuǎn)化體系建立[A];中國園藝學(xué)會第九屆學(xué)術(shù)年會論文集[C];2001年

7 李名楊;徐淳;;農(nóng)桿菌介導(dǎo)的荔枝細(xì)胞遺傳轉(zhuǎn)化研究[A];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會第五次會議論文摘要匯編[C];1992年

8 覃銘;劉璨;李玲;;農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花生AhNCED1基因遺傳轉(zhuǎn)化體系研究[A];全國“植物生物技術(shù)及其產(chǎn)業(yè)化”研討會論文摘要集[C];2007年

9 胡春華;魏岳榮;易干軍;黃永紅;;農(nóng)桿菌介導(dǎo)GUS基因轉(zhuǎn)化貢蕉的研究[A];慶祝中國園藝學(xué)會創(chuàng)建80周年暨第11次全國會員代表大會論文摘要集[C];2009年

10 劉晶;陳華;李平;李銀心;;農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)雙抗鹽基因番茄的研究[A];中國植物學(xué)會七十周年年會論文摘要匯編（1933—2003）[C];2003年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 史勇;農(nóng)桿菌毒性效應(yīng)因子與宿主相關(guān)蛋白互作研究及功能驗(yàn)證[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2014年

2 吳關(guān)庭;農(nóng)桿菌介導(dǎo)高羊茅遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及CBF耐逆相關(guān)基因的導(dǎo)入[D];浙江大學(xué);2004年

3 梁雪蓮;農(nóng)桿菌組培及三種非組培法在小麥和玉米上轉(zhuǎn)化外源Bar基因研究[D];山西農(nóng)業(yè)大學(xué);2002年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張國剛;農(nóng)桿菌介導(dǎo)茄子遺傳轉(zhuǎn)化體系研究[D];上海交通大學(xué);2015年

2 張欣;基于熒光報(bào)告載體的農(nóng)桿菌atu5117基因啟動子表達(dá)調(diào)控影響因素的研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2015年

3 孫運(yùn)奇;農(nóng)桿菌介導(dǎo)的斑玉蕈遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

4 彭微;農(nóng)桿菌VirD5在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化過程中的功能研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

5 程寧寧;農(nóng)桿菌介導(dǎo)紫花苜蓿子葉節(jié)的遺傳轉(zhuǎn)化研究[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

6 胡詩維;玉米脆稈突變體基因初定位及芒草農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因體系初探[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

7 王潔;利用農(nóng)桿菌對兩種微藻進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的初步研究[D];中國海洋大學(xué);2013年

8 王丹;用農(nóng)桿菌浸種法建立白三葉和中華結(jié)縷草遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

9 王成杰;農(nóng)桿菌介導(dǎo)小麥非組培轉(zhuǎn)化方法的探討[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

10 鐘光馳;百合高頻再生體系的建立及農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)入[D];西南大學(xué);2007年

，

本文編號：1107657