本文關(guān)鍵詞：牛規(guī)模化轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系構(gòu)建軌跡和展望，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《內(nèi)蒙古大學(xué)》 2016年

正常受精、克隆與轉(zhuǎn)基因牛的成纖維細(xì)胞microRNA表達(dá)譜分析

呂洋  

【摘要】：機(jī)體維持正常的生理機(jī)能和健康,需要控制體內(nèi)代謝平衡。一些重要的轉(zhuǎn)錄因子可以直接或間接的影響營養(yǎng)和代謝鏈,如膽固醇、脂質(zhì)、葡萄糖和胰島素等可以快速改變基因表達(dá)的程序,從而維持代謝平衡。microRNAs(miRNAs)可以調(diào)控動(dòng)物多種生理生化活動(dòng),在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平表現(xiàn)為重要的調(diào)控分子,miRNAs可能也參與調(diào)控體細(xì)胞克隆動(dòng)物和轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物的表觀遺傳。利用Solexa測序技術(shù),分別檢測并分析2頭體內(nèi)受精(in vivo fertilization,Ferti)牛、2頭克隆牛(somatic cell nuclear transfer,SCNT)和2頭轉(zhuǎn)fat-1基因牛(transgenic, TG)的成纖維細(xì)胞中的miRNA表達(dá)譜,共建立了6個(gè)miRNAs文庫。利用Mireap軟件,分析miRNA的表達(dá)差異,探討成纖維細(xì)胞中miRNAs的表達(dá)規(guī)律,并預(yù)測了差異miRNAs調(diào)控的靶基因。通過基因GO (Gene ontology)數(shù)據(jù)庫富集分析和全基因組及代謝途徑數(shù)據(jù)庫(KEGG)通路分析,研究了這些靶基因參與的生物學(xué)通路,初步揭示了體內(nèi)受精、克隆和轉(zhuǎn)基因來源的牛中的miRNA表達(dá)和靶向基因之間的關(guān)系。結(jié)果表明：1.運(yùn)用miRNAs測序技術(shù),共檢測了367個(gè)已知miRNAs,其中83個(gè)、19個(gè)和23個(gè)已知miRNAs分別在體內(nèi)受精、克隆和轉(zhuǎn)fat-1基因牛中特異性表達(dá),14個(gè)已知miRNAs在三者中共同表達(dá)；新發(fā)現(xiàn)了178個(gè)數(shù)據(jù)庫未公布的miRNAs,其中17個(gè)、1個(gè)和4個(gè)新的候選miRNAs分別在體內(nèi)受精、克隆和轉(zhuǎn)fat-1基因牛中特異性表達(dá),1個(gè)新的候選miRNA在三者中共同表達(dá)。2.通過篩選體內(nèi)受精、克隆和轉(zhuǎn)fat-1基因牛成纖維細(xì)胞中的差異表達(dá)miRNA,發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞中存在一系列上調(diào)和下調(diào)的miRNA。通過Real time RT-PCR方法檢測、驗(yàn)證和比較體內(nèi)受精、克隆和轉(zhuǎn)基因組三組中表達(dá)量前10個(gè)miRNA的差異,同時(shí)對(duì)表達(dá)量高的2個(gè)新的候選miRNA進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證,并預(yù)測部分高表達(dá)的候選miRNA結(jié)構(gòu)。GO富集分析和KEGG通路分析顯示,差異表達(dá)miRNA對(duì)應(yīng)靶基因顯著富集的通路主要在代謝通路、MAPK信號(hào)通路、鈣離子信號(hào)通路、嘌呤代謝通路、泛素介導(dǎo)的蛋白水解通路、嘧啶代謝通路和細(xì)胞周期通路等7個(gè)生物學(xué)通路。3.通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測FGF10、LPL和ATGL可能作為bta-miR-21的靶基因,熒光定量PCR驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn),與克隆牛和轉(zhuǎn)基因牛成纖維細(xì)胞相比,FGF10和ATGL的mRNA在體內(nèi)受精牛成纖維細(xì)胞中表達(dá)顯著降低,而bta-miR-21在體內(nèi)受精牛成纖維細(xì)胞中表達(dá)顯著升高,初步認(rèn)為bta-miR-21與FGF10和ATGL的表達(dá)存在負(fù)調(diào)控的關(guān)系。4.microRNA的功能鑒定。利用在體外水平過表達(dá)或敲減bta-miR-21,檢測靶基因的表達(dá)變化,進(jìn)一步證明bta-miR-21與FGF10和ATGL的靶向關(guān)系,bta-miR-21可能通過調(diào)控FGF10和ATGL的表達(dá)發(fā)揮作用。結(jié)論：1.本研究建立了遺傳背景一致,不同來源胚胎(體內(nèi)受精、克隆和轉(zhuǎn)fat-1基因牛)成纖維細(xì)胞的miRNA文庫,獲得了可能影響克隆、轉(zhuǎn)基因克隆后代發(fā)育的miRNA信息,為深入揭示克隆與轉(zhuǎn)基因克隆胚胎發(fā)育異常的機(jī)制提供了重要參考。2.本研究發(fā)現(xiàn)bta-miR-21及其靶基因FGF10和ATGL在體內(nèi)受精、克隆和轉(zhuǎn)fat-1基因牛胎兒成纖維細(xì)胞中具有調(diào)控作用,推測bta-miR-21及其靶基因FGF10和ATGL可能是克隆與轉(zhuǎn)基因克隆胚胎發(fā)育調(diào)控的重要靶標(biāo)。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78
【目錄】：

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