本文關(guān)鍵詞：玫瑰花青素苷合成相關(guān)基因的克隆及表達分析

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【摘要】：玫瑰是薔薇科薔薇屬重要的觀花植物,現(xiàn)已應(yīng)用于園林景觀綠化、食品工業(yè)、藥用產(chǎn)業(yè)等各個方面,具有很大的觀賞價值和經(jīng)濟價值。花色是玫瑰的重要觀賞性狀之一,玫瑰品種較多,但花色單一,嚴重的自交和種間雜交障礙限制了玫瑰花色的創(chuàng)新及在國內(nèi)外市場的發(fā)展。分子育種是培育新品種的新方法,目前對玫瑰花色發(fā)育的分子基礎(chǔ)還缺乏深入研究,這在一定程度上制約了玫瑰花色的改良�；ㄇ嗨厥侵参锘ㄆ鞴俚淖钪饕某噬镔|(zhì),在模式植物中其生物合成途徑已經(jīng)研究的較為詳細,該途徑大多數(shù)結(jié)構(gòu)基因和一部分調(diào)控基因均己分離。但有關(guān)玫瑰花色形成的機理研究尚未見報道。因此對玫瑰花青素合成途徑中結(jié)構(gòu)基因的克隆與表達分析對于闡明玫瑰花色形成機理、利用基因工程培育新品種具有重要意義。本研究以‘紫枝’玫瑰花瓣為材料,利用RT-PCR的方法分離了4個關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因(CHS、CHI、F3H、DFR)的全長cDNA序列和1個關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因(ANS)的部分cDNA序列。采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)的方法,分析5個關(guān)鍵基因在玫瑰不同花色品種、不同開花時期的差異性表達。主要研究結(jié)果如下:1.以‘紫枝’玫瑰盛花期花瓣的cDNA為模板進行PCR擴增,獲得了CHS、CHI、F3H、DFR和ANS五個結(jié)構(gòu)基因的cDNA序列,命名為RrCHS、RrCHI、RrF3H、RrDFR和RrANS。其中RrCHS、RrCHI、RrF3H和RrDFR為全長cDNA序列,分別為1167bp、711bp、1092bp和1047bp,編碼389、237、364和349個氨基酸,RrANS為部分cDNA序列,長度為562bp。利用NCBI的Blastp工具進行比對分析發(fā)現(xiàn),5個結(jié)構(gòu)基因與其它已知植物的相關(guān)基因均具有較高的同源性。5個結(jié)構(gòu)基因獲得的GenBank登錄號分別為ALR74720.1、ALR74721.1、ALR74723.1、ALR74719.1、ALR74722.1。2.運用生物信息學(xué)分析軟件對4個結(jié)構(gòu)基因的蛋白分子量、理論等電點、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點和糖基化位點、二級結(jié)構(gòu)及保守結(jié)構(gòu)域等進行了分析,同時在多序列比對的基礎(chǔ)上構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹。系統(tǒng)進化分析表明,4個基因的系統(tǒng)進化樹基本符合植物分類學(xué)分類,且具有較明顯的種屬特性。3.對玫瑰3個品種5個時期的花青素含量進行測定,結(jié)果顯示:‘紫枝’玫瑰花青素苷含量遠高于‘粉紫枝’玫瑰,‘白紫枝’玫瑰含量最低,3個玫瑰品種的花青素苷含量在整個開花過程中均呈逐漸下降趨勢,與花色變化結(jié)果一致。4.利用實時熒光定量技術(shù)(qRT-PCR)對本研究克隆的5個結(jié)構(gòu)基因(RrCHS、RrCHI、RrF3H、RrDFR和RrANS)在3個玫瑰品種(‘紫枝’玫瑰、‘白紫枝’玫瑰和‘粉紫枝’玫瑰)5個開花時期表達模式進行分析,結(jié)果表明,5個結(jié)構(gòu)基因在3個玫瑰品種不同開花時期均有表達,但表達模式存在明顯的差異。RrCHS和RrDFR在3個玫瑰品種的開花過程中整體上均呈下降的表達趨勢,盛花末期的表達量最低。RrCHI在3個玫瑰品種中表達量都是隨著花的開放逐漸增加,而后隨著花的萎蔫又下降。RrF3H和RrA NS在3個玫瑰品種花朵開放過程中的相對表達量變化沒有一定規(guī)律可循。此外,RrCH S、RrCHI、RrDFR與玫瑰開花過程中花青苷形成和變化密切相關(guān),RrF3H、RrANS與花青苷含量變化沒有明顯的對應(yīng)關(guān)系。5.利用實時熒光定量技術(shù)(qRT-PCR)對5個結(jié)構(gòu)基因(RrCHS、RrCHI、RrF3H、RrDFR和RrANS)在‘紫枝’玫瑰5個組織部位(莖、葉、雄蕊、雌蕊、花瓣)中的表達模式進行分析。結(jié)果表明,5個結(jié)構(gòu)基因在不同組織部位中均有表達,但表達水平差異明顯。RrCHS、RrCHI和RrDFR的表達特征相似,即在花瓣中的表達量較高,在莖、葉、雄蕊、雌蕊中的表達量相對較低。RrF3H在莖、葉中的表達量較高,在雄蕊、雌蕊、花瓣中的表達量較低。RrANS在莖中的表達量要明顯高于其他組織部位,推測這兩個基因除參與花青苷合成外,還參與了玫瑰其他代謝過程。
【關(guān)鍵詞】：玫瑰 花青素苷 結(jié)構(gòu)基因 克隆 表達分析
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S685.12;Q943.2
【目錄】：

• 符號說明4-8
• 中文摘要8-10
• Abstract10-12
• 1 前言12-21
• 1.1 玫瑰花色育種的發(fā)展現(xiàn)狀12-14
• 1.1.1 玫瑰品種的概況12-13
• 1.1.2 玫瑰花色育種的相關(guān)研究13-14
• 1.2 花青素苷生物合成途徑及相關(guān)基因的研究14-21
• 1.2.1 花青素苷生物合成途徑的研究14-16
• 1.2.2 花青素苷生物合成途徑中相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的研究16-21
• 1.2.2.1 查爾酮合成酶(Chalcone synthase，CHS)16-17
• 1.2.2.2 查爾酮異構(gòu)酶(Chalcone isomerase，CHI)17-18
• 1.2.2.3 黃烷酮 3-羥化酶(Flavonoid 3-hydroxylase，，F(xiàn)3H)18-19
• 1.2.2.4 二氫黃酮醇還原酶(Dihydroflavonol 4-reductas，DFR)19-20
• 1.2.2.5 花青素合成酶（Anthocyanidin synthase，ANS）20-21
• 1.3 本研究目的及意義21
• 2.材料與方法21-31
• 2.1 玫瑰花青素苷合成相關(guān)基因的克隆21-27
• 2.1.1 試驗材料21
• 2.1.2 菌株和質(zhì)粒21-22
• 2.1.3 主要試劑22
• 2.1.4 主要試劑配制22
• 2.1.5 主要儀器22-23
• 2.1.6 試驗方法23-27
• 2.1.6.1 總RNA提取23
• 2.1.6.2 總RNA質(zhì)量檢測23-24
• 2.1.6.3 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈24
• 2.1.6.4 引物設(shè)計24-25
• 2.1.6.5 PCR反應(yīng)體系和擴增條件25
• 2.1.6.6 PCR產(chǎn)物的檢測25
• 2.1.6.7 目的片段的回收、連接和轉(zhuǎn)化25-27
• 2.1.6.8 生物信息學(xué)分析27
• 2.2 玫瑰花青素苷合成相關(guān)基因的表達分析27-30
• 2.2.1 試驗材料28
• 2.2.2 主要試劑28
• 2.2.3 主要儀器28-29
• 2.2.4 試驗方法29-30
• 2.2.4.1 總RNA提取以及純度與完整性的鑒定29
• 2.2.4.2 cDNA的合成29
• 2.2.4.3 引物設(shè)計29-30
• 2.2.4.4 實時熒光定量RT-PCR30
• 2.3 玫瑰花青素苷含量的測定30-31
• 2.3.1 試驗材料30
• 2.3.2 主要試劑30-31
• 2.3.3 主要儀器31
• 2.3.4 試驗方法31
• 3.結(jié)果與分析31-56
• 3.1 玫瑰花青素苷合成相關(guān)基因的克隆31-49
• 3.1.1 玫瑰花總RNA質(zhì)量檢測31
• 3.1.2 玫瑰RrCHS、RrCHI、RrF3H、RrDFR和RrANS基因的克隆31-32
• 3.1.3 玫瑰RrCHS、RrCHI、RrF3H和RrDFR的生物信息學(xué)分析32-49
• 3.1.3.1 RrCHS的序列與生物信息學(xué)分析32-36
• 3.1.3.2 RrCHI的序列與生物信息學(xué)分析36-40
• 3.1.3.3 RrF3H的序列與生物信息學(xué)分析40-44
• 3.1.3.4 RrDFR的序列與生物信息學(xué)分析44-49
• 3.2 玫瑰花青素苷合成相關(guān)基因的表達分析49-55
• 3.2.1 玫瑰花青素苷合成途徑關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因的時間表達模式分析49-53
• 3.2.1.1 RrCHS基因在3個玫瑰品種5個開花時期的表達分析49-50
• 3.2.1.2 RrCHI基因在3個玫瑰品種5個開花時期的表達分析50
• 3.2.1.3 RrF3H基因在3個玫瑰品種5個開花時期的表達分析50-51
• 3.2.1.4 RrDFR基因在3個玫瑰品種5個開花時期的表達分析51-52
• 3.2.1.5 RrANS基因在3個玫瑰品種5個開花時期的表達分析52-53
• 3.2.2 玫瑰花青素苷合成途徑關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因的空間表達模式分析53-55
• 3.2.2.1 RrCHS基因的器官特異性表達分析53
• 3.2.2.2 RrCHI基因的器官特異性表達分析53-54
• 3.2.2.3 RrF3H基因的器官特異性表達分析54
• 3.2.2.4 RrDFR基因的器官特異性表達分析54-55
• 3.2.2.5 RrANS基因的器官特異性表達分析55
• 3.3 玫瑰花青素苷含量的測定55-56
• 4 討論56-62
• 4.1 玫瑰花青素苷合成途徑中結(jié)構(gòu)基因的克隆與序列分析56-57
• 4.2 玫瑰開花過程中花青素合成結(jié)構(gòu)基因表達特性分析57-60
• 4.2.1 玫瑰開花過程中RrCHS基因表達特性分析57-58
• 4.2.2 玫瑰開花過程中RrCHI基因表達特性分析58-59
• 4.2.3 玫瑰開花過程中RrDFR基因表達特性分析59
• 4.2.4 玫瑰開花過程中RrF3H和RrANS基因表達特性分析59-60
• 4.3 玫瑰開花過程中花青素合成結(jié)構(gòu)基因表達與花青苷積累及花色的關(guān)系60-61
• 4.4 玫瑰不同組織部位花青素合成結(jié)構(gòu)基因表達特性分析61-62
• 5 結(jié)論62-63
• 創(chuàng)新點63-64
• 參考文獻64-74
• 致謝74-75
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文75

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張玲;徐宗大;湯騰飛;張輝;趙蘭勇;;‘紫枝’玫瑰(Rosa rugosa ‘Zi zhi’)開花過程花青素相關(guān)化合物及代謝途徑分析[J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);2015年13期

2 陳躍華;許云;吳文嬙;劉林婭;黃小龍;黃東益;;參薯DaANS基因克隆及表達差異分析[J];植物生理學(xué)報;2015年06期

3 劉秀明;楊文婷;張雪萌;焦重達;姚娜;楊美英;官麗莉;李海燕;李校X;;紅花查爾酮異構(gòu)酶基因全長cDNA的克隆及表達分析[J];西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2015年07期

4 羅群鳳;胥猛;馮源恒;徐嘉娟;李火根;;北美鵝掌楸LtCHS基因的克隆及生物信息學(xué)與組織表達特征分析[J];林業(yè)科學(xué);2015年05期

5 王華;李茂福;楊媛;金萬梅;;果實花青素生物合成分子機制研究進展[J];植物生理學(xué)報;2015年01期

6 田玲;李斌;張晶瑩;范勝栩;閆淑榮;孫君明;;大豆子粒發(fā)育過程中異黃酮合成相關(guān)酶基因的表達模式與異黃酮積累的相關(guān)分析[J];植物遺傳資源學(xué)報;2014年06期

7 于曉艷;邢樹堂;趙蘭勇;;玫瑰與月季種間雜交障礙原因分析[J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);2014年15期

8 繆�？�;陳劍;孫浩;王毅;王晨晨;原曉龍;楊宇明;王娟;;七彩紅竹二氫黃酮醇4-還原酶基因IhDFR1的克隆及表達分析[J];植物生理學(xué)報;2014年04期

9 許志茹;劉通;崔國新;李春雷;馬靜;李玉花;;蕪菁二氫黃酮醇4 還原酶基因的克隆與功能鑒定[J];園藝學(xué)報;2014年04期

10 王晨晨;畢瑋;王娟;周旭;楊宇明;王毅;;七彩紅竹查爾酮異構(gòu)酶基因IhCHI1的克隆與表達分析[J];西部林業(yè)科學(xué);2014年02期

本文編號：1088589