本文關(guān)鍵詞：結(jié)合不對稱PCR技術(shù)構(gòu)建雞NDV-IBV-ILTV聯(lián)合檢測基因芯片

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【摘要】：基因芯片(gene chip)是依據(jù)核酸雜交原理發(fā)展的一種生物新技術(shù),在生命科學(xué)研究領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值。本研究將不對稱PCR和基因芯片兩種技術(shù)相結(jié)合,構(gòu)建了同步檢測雞(Gallus gallus)傳染性喉氣管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)的共檢基因芯片。分別選取ILTV的胸苷激酶(thymidine kinase,TK)和糖蛋白B(glycoproteins B,g B)基因、NDV的融合蛋白(fusion,F)和血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白(haemagglutinin-neuraminidase,HN)基因以及IBV的膜蛋白(membrane,M)和核衣殼(nucleocapsid,N)基因設(shè)計引物,從重組質(zhì)粒菌中擴增制備探針基因,用乙醇沉淀法純化后點制于氨基修飾的載玻片上,制備基因芯片;靶基因用cy3標(biāo)記引物,進行不對稱PCR擴增,擴增的熒光標(biāo)記單鏈產(chǎn)物與芯片雜交。不對稱PCR結(jié)果顯示,當(dāng)限制性引物與非限制性引物濃度比例在1∶10時ILTV-TK、NDV-HN和IBV-N的單鏈產(chǎn)物增加最多,當(dāng)濃度比在1∶20時,ILTV-g B、NDV-F和IBV-M的單鏈產(chǎn)物增加最多;相應(yīng)的標(biāo)記樣品與3種病毒檢測芯片雜交后,均出現(xiàn)較強的雜交信號,而陰性對照檢測不到熒光信號,靈敏性實驗表明,當(dāng)DNA濃度為1.8×104拷貝時雜交仍為陽性。本研究構(gòu)建的診斷基因芯片對12份臨床樣品進行初步應(yīng)用檢測,與PCR檢測技術(shù)檢出率基本一致。本實驗所建立的聯(lián)合檢測基因芯片能夠快速、準(zhǔn)確、高通量的診斷NDV-IBV-ILTV,可以應(yīng)用于集約化養(yǎng)殖業(yè)中對多種雞疫病病毒的檢測。
【作者單位】： 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院/動物傳染病與基因芯片實驗室;崇州市農(nóng)村發(fā)展局;
【關(guān)鍵詞】： 雞 新城疫病毒(NDV) 傳染性喉氣管炎病毒(ILTV) 傳染性支氣管炎病毒(IBV) 不對稱PCR 芯片構(gòu)建
【基金】：公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項項目(No.201203056)
【分類號】：S852.65
【正文快照】： *同等貢獻作者新城疫(Newcastle disease,ND)是一種禽類急性高度接觸性傳染病,主要特征是高致病性和隱性感染,呼吸困難、神經(jīng)癥狀、內(nèi)出血、腺胃出血及對應(yīng)相關(guān)淋巴組織壞死等癥狀(Hu et al.,2010)。雞(Gallus gallus)傳支病(infectious bronchitis,IB)是由傳染性支氣管病毒變

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