發(fā)布時(shí)間：2017-10-21 00:05

  本文關(guān)鍵詞：葫蘆科栝樓屬植物鯊烯合酶SS基因克隆及原核表達(dá)

  更多相關(guān)文章： 截葉栝樓 栝樓 紅花栝樓 鯊烯合酶 基因克隆 序列分析 原核表達(dá)分析

【摘要】：鯊烯合酶(squalene synthase, SS, EC2.5.1.21)是植物甾醇和三萜皂苷生物合成通路過程中的一個(gè)關(guān)鍵酶,催化著兩分子的法呢酯焦磷酸(FPP)縮合生成鯊烯(SQ),而鯊烯則在2,3-氧化鯊烯環(huán)化酶催化下,生成三萜、甾醇、膽固醇等重要的植物次生代謝產(chǎn)物。鯊烯合酶SS在鯊烯后續(xù)生物合成通路中處于關(guān)鍵地位,其含量和活性決定了后續(xù)產(chǎn)物的合成。因而,近年來人們對鯊烯合酶的研究倍受重視。本研究采用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)及末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)法,首次分離得到截葉栝樓、栝樓鯊烯合酶SS基因全長cDNA序列,同時(shí)對截葉栝樓、栝樓、紅花栝樓SS基因進(jìn)行了原核表達(dá)及生物信息學(xué)分析,并對推衍的蛋白質(zhì)性質(zhì)特征進(jìn)行了比較,為葫蘆科栝樓屬植物三萜合成通路中關(guān)鍵酶SS的研究奠定了基礎(chǔ)。本論文的主要研究結(jié)果如下：1、SS基因克隆：(1)采用RACE及TdT酶法獲得截葉栝樓的兩個(gè)全長cDNA克隆。其cDNA序列全長分別為1983 bp和1902 bp,差異位于編碼區(qū)外的3'UTR,包含一個(gè)1254 bp的開放閱讀框序列,編碼417個(gè)氨基酸殘基,相對分子量為47.6 kD。(2)采用3'RACE及5'RACE的方法,克隆得到栝樓SS基因cDNA序列,序列長度為1522 bp,其中包括1254 bp的開放讀碼框序列,編碼417個(gè)氨基酸殘基,分子量大小約為47.6 kD。2、SS基因序列分析：通過NCBI的Blast比對,發(fā)現(xiàn)截葉栝樓SS基因的核苷酸序列與已知植物SS核苷酸序列的同源性為78%～91%,氨基酸序列同源性為79%～94%；栝樓SS基因的核苷酸序列與已知植物SS核苷酸序列的同源性為78%～93%,氨基酸序列同源性為79%～95%。通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析,發(fā)現(xiàn)截葉栝樓、栝樓SS與羅漢果、絞股藍(lán)、紅花栝樓、木鱉子的SS親緣關(guān)系最近,與植物分類學(xué)上的植物親緣關(guān)系一致。我們克隆得到的截葉栝樓、栝樓SS的cDNA序列,與葫蘆科植物鯊烯合酶基因的同源性最高,與預(yù)測結(jié)果相符合。3、原核表達(dá)分析：分別將截葉栝樓、紅花栝樓、栝樓鯊烯合酶基因的編碼序列插入到原核表達(dá)載體pET32a(+)中,構(gòu)建的重組原核表達(dá)載體pET32a(+)-SS,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中,通過IPTG誘導(dǎo)后經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳檢測,電泳結(jié)果表明重組體成功地在BL21(DE3)中表達(dá)出約66kD的融合蛋白,其中pET32a(+)表達(dá)標(biāo)簽大小約為18 kD。本研究成功克隆得到截葉括樓和栝樓鯊烯合酶SS基因的全長cDNA序列,并對截葉栝樓、紅花栝樓及栝樓鯊烯合酶進(jìn)行了原核表達(dá)分析,為進(jìn)一步研究葫蘆科植物三萜合成通路中關(guān)鍵酶SS的正選擇位點(diǎn)及功能的關(guān)聯(lián)性分析奠定基礎(chǔ)。為深入了解葫蘆科栝樓屬植物三萜皂苷生物合成途徑及其調(diào)控的分子機(jī)制,明確三萜皂苷合成途徑中關(guān)鍵酶的結(jié)構(gòu)特征及其功能,從而在分子水平上實(shí)現(xiàn)三萜皂苷生物合成的人工調(diào)控,提高其有效成分三萜皂苷的生物合成量,具有重要的意義。
【關(guān)鍵詞】：截葉栝樓 栝樓 紅花栝樓 鯊烯合酶 基因克隆 序列分析 原核表達(dá)分析
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2
【目錄】：

• 個(gè)人簡歷3-6
• 摘要6-8
• ABSTRACT8-12
• 前言12-14
• 第一部分 栝樓屬植物鯊烯合酶(SS)基因克隆及序列分析14-51
• 一、截葉栝樓鯊烯合酶SS基因全長cDNA序列克隆14-29
• 1. 材料與儀器14-16
• 1.1 植物材料14
• 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器14
• 1.3 主要試劑14-15
• 1.4 溶液配制15
• 1.5 RNA酶處理15-16
• 2. 方法16-29
• 2.1 截葉栝樓總RNA的提取及電泳檢測16-17
• 2.2 截葉栝樓SS基因3'RACE擴(kuò)增17-23
• 2.3 截葉栝樓SS基因5'RACE擴(kuò)增23-28
• 2.4 截葉栝樓SS基因全長cDNA拼接及生物信息學(xué)分析28-29
• 二、栝樓鯊烯合酶SS基因cDNA克隆29-35
• 1 材料與儀器29
• 2 方法29-35
• 2.1 栝樓總RNA的提取及電泳檢測29
• 2.2 栝樓SS基因3'RACE擴(kuò)增29-32
• 2.3 栝樓SS基因5'RACE擴(kuò)增32-34
• 2.4 栝樓SS基因cDNA拼接及生物信息學(xué)分析34-35
• 三、結(jié)果與分析35-51
• 1.1 植物總RNA電泳檢測35
• 1.2 3'RACE及5'RACE擴(kuò)增電泳結(jié)果35-36
• 1.3 菌落PCR鑒定陽性克隆36-38
• 1.4 栝樓屬植物鯊烯合酶SS基因生物信息學(xué)分析38-51
• 第二部分 栝樓屬植物鯊烯合酶SS基因的原核表達(dá)51-64
• 1 材料與儀器51-53
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料51
• 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器51
• 1.3 溶液配制51-53
• 2 方法53-59
• 2.1 目的片段SS與pET32a(+)原核表達(dá)載體構(gòu)建重組體53-58
• 2.2 重組質(zhì)粒pET32a(+)-SS誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE電泳鑒定58
• 2.3 誘導(dǎo)表達(dá)蛋白SDS-PAGE電泳鑒定58-59
• 3 結(jié)果與分析59-61
• 3.1 栝樓屬植物SS基因ORF擴(kuò)增59
• 3.2 栝樓屬植物SS基因原核表達(dá)SDS-PAGE電泳結(jié)果59-61
• 4 討論61-64
• 小結(jié)64-65
• 參考文獻(xiàn)65-69
• 綜述69-83
• 參考文獻(xiàn)78-83
• 致謝83-84
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文84

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