本文關(guān)鍵詞：火龍果CAT基因在煙草中的遺傳轉(zhuǎn)化及功能分析

  更多相關(guān)文章： 火龍果CAT基因 植物表達(dá)載體 遺傳轉(zhuǎn)化 基因表達(dá) 功能驗(yàn)證

【摘要】：逆境脅迫嚴(yán)重影響植物的分布、生長(zhǎng)發(fā)育及品質(zhì)的形成。在逆境脅迫下,植物積累了大量的活性氧(ROS),從而導(dǎo)致膜脂、DNA及其他細(xì)胞組分的嚴(yán)重?fù)p傷。過(guò)氧化氫酶(CAT)屬血紅蛋白酶類(lèi),主要催化H2O2分解為H2O與O2,CAT的過(guò)量表達(dá)可有效清除植株體內(nèi)的ROS,提高其對(duì)氧化脅迫的抗性�；瘕埞�(Hylocereus undulatus)為仙人掌科三角柱屬的果用栽培種,原產(chǎn)于中美洲熱帶沙漠地區(qū),耐熱耐旱,具有很高的利用價(jià)值。前期工作中,我們克隆了火龍果CAT基因(HuCAT),并在mRNA水平上分析了該基因與非生物脅迫的關(guān)系。本文擬構(gòu)建HuCAT的植物表達(dá)載體,并通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化模式植物煙草,在干旱與低溫逆境脅迫下對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草的生理指標(biāo)進(jìn)行分析,以期進(jìn)一步探討HuCAT的高效超表達(dá)提高植物抗逆性的潛在功能。主要結(jié)果如下:1、據(jù)前期克隆的火龍果過(guò)氧化氫酶基因(HuCAT)設(shè)計(jì)特異引物,從克隆載體PMD18T-HuCAT中擴(kuò)增出特異帶,將其連入植物表達(dá)載體pSH737,構(gòu)建了CaMV35s啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)載體pSH737-HuCAT。2、采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草,獲得37個(gè)抗性植株,經(jīng)GUS組織化學(xué)染色及PCR擴(kuò)增鑒定,有29個(gè)株系為轉(zhuǎn)基因植株;經(jīng)半定量RT-PCR及熒光定量PCR檢測(cè),篩選出高表達(dá)株系22個(gè)。3、以PEG-6000溶液模擬干旱脅迫條件,測(cè)定轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱相關(guān)生理指標(biāo)。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因植株水勢(shì)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化物酶(POD)活性、葉綠素、可溶性糖(SS)、可溶性蛋白(SP)和脯氨酸(PRO)含量、相對(duì)含水量均高于野生型;丙二醛(MDA)含量、過(guò)氧化氫(H2O2)含量、相對(duì)電導(dǎo)率低于野生型,說(shuō)明轉(zhuǎn)HuCAT基因提高了煙草的抗旱性。4、在恒溫光照培養(yǎng)箱里低溫(4℃)處理2天,轉(zhuǎn)基因煙草CAT、SOD和POD活性,可溶性糖、可溶性蛋白及PRO含量均高于野生型,而MDA含量低于野生型,意味著轉(zhuǎn)HuCAT基因提高了煙草的抗寒性。因此,HuCAT的高效表達(dá)能夠提高煙草抗干旱和低溫脅迫的能力,其作用機(jī)理與消除逆境脅迫下的氧化脅迫相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：火龍果CAT基因 植物表達(dá)載體 遺傳轉(zhuǎn)化 基因表達(dá) 功能驗(yàn)證
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S667.9;Q943.2
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 名詞縮寫(xiě)表9-10
• 1 文獻(xiàn)綜述10-23
• 1.1 逆境脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)的影響10-11
• 1.1.1 干旱脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)的影響10-11
• 1.1.2 低溫脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)的影響11
• 1.2 植物適應(yīng)逆境脅迫的機(jī)制11-17
• 1.2.1 植物適應(yīng)逆境脅迫的形態(tài)機(jī)制11-12
• 1.2.2 植物適應(yīng)逆境脅迫的生理生化機(jī)制12-15
• 1.2.3 植物逆境脅迫下的基因應(yīng)答機(jī)制15-17
• 1.3 過(guò)氧化氫酶與植物抗逆性17-19
• 1.3.1 過(guò)氧化氫酶的結(jié)構(gòu)與功能17-18
• 1.3.2 過(guò)氧化氫酶的抗氧化作用18
• 1.3.3 CAT基因工程研究18-19
• 1.4 基因的功能驗(yàn)證19-20
• 1.4.1 基因的超表達(dá)用于功能驗(yàn)證19-20
• 1.4.2 基因失活在基因功能分析的作用20
• 1.5 火龍果的抗逆相關(guān)基因20-21
• 1.6 本研究的目的、意義及技術(shù)路線(xiàn)21-23
• 1.6.1 目的與意義21-22
• 1.6.2 技術(shù)路線(xiàn)22-23
• 2 材料與方法23-47
• 2.1 試驗(yàn)材料23
• 2.1.1 試驗(yàn)材料23
• 2.1.2 干旱脅迫23
• 2.1.3 低溫脅迫23
• 2.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器設(shè)備23-24
• 2.2.1 主要試劑23-24
• 2.2.2 主要儀器24
• 2.3 HuCAT基因植物表達(dá)載體構(gòu)建24-33
• 2.3.1 添加酶切位點(diǎn)的引物設(shè)計(jì)24-25
• 2.3.2 中間表達(dá)載體的構(gòu)建25-29
• 2.3.3 植物表達(dá)載體的構(gòu)建29-32
• 2.3.4 植物表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA440432-33
• 2.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)煙草遺傳轉(zhuǎn)化33-36
• 2.4.1 培養(yǎng)基33
• 2.4.2 煙草葉片材料的處理33
• 2.4.3 農(nóng)桿菌的培養(yǎng)及活化33-34
• 2.4.4 HuCAT遺傳轉(zhuǎn)化煙草34
• 2.4.5 GUS組織化學(xué)染色檢測(cè)34
• 2.4.6 PCR分子檢測(cè)34-36
• 2.5 轉(zhuǎn)基因植株中HuCAT基因的表達(dá)分析36-40
• 2.5.1 PCR模板制備36-38
• 2.5.2 半定量RT-PCR38
• 2.5.3 熒光定量PCR38-40
• 2.6 轉(zhuǎn)基因煙草抗旱生理生化指標(biāo)的測(cè)定40-46
• 2.6.1 水勢(shì)40
• 2.6.2 相對(duì)含水量40-41
• 2.6.3 過(guò)氧化氫（H2O2）含量41
• 2.6.4 可溶性糖（SS）含量41-42
• 2.6.5 可溶性蛋白（SP）含量42
• 2.6.6 葉綠素含量42-43
• 2.6.7 過(guò)氧化氫酶（CAT）活性43
• 2.6.8 超氧化物歧化酶（SOD）活性43-44
• 2.6.9 過(guò)氧化物酶（POD）活性44-45
• 2.6.10 脯氨酸（PRO）含量45
• 2.6.11 丙二醛（MDA）含量45
• 2.6.12 相對(duì)電導(dǎo)率（REC）45-46
• 2.7 轉(zhuǎn)基因煙草抗寒生理生化指標(biāo)的測(cè)定46
• 2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析46-47
• 3 結(jié)果與分析47-70
• 3.1 HuCAT基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建47-49
• 3.1.1 目的基因的PCR擴(kuò)增47
• 3.1.2 HuCAT的T載體克隆與測(cè)序驗(yàn)證47-48
• 3.1.3 載體質(zhì)粒雙酶切48-49
• 3.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)煙草遺傳轉(zhuǎn)化49-50
• 3.2.1 pSH737-HuCAT轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌49-50
• 3.2.2 HuCAT遺傳轉(zhuǎn)化煙草50
• 3.3 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定50-51
• 3.3.1 GUS組織化學(xué)染色50-51
• 3.3.2 PCR檢測(cè)51
• 3.4 HuCAT表達(dá)分析51-56
• 3.4.1 PCR模板的制備51-52
• 3.4.2 半定量RT-PCR檢測(cè)52-54
• 3.4.3 HuCAT表達(dá)的熒光定量PCR檢測(cè)54-56
• 3.5 干旱脅迫對(duì)轉(zhuǎn)HuCAT煙草生長(zhǎng)的影響56
• 3.6 干旱脅迫下生理生化指標(biāo)的變化56-65
• 3.6.1 水勢(shì)56-57
• 3.6.2 相對(duì)含水量57-58
• 3.6.3 過(guò)氧化氫（H202）含量58
• 3.6.4 可溶性糖（SS）含量58-59
• 3.6.5 可溶性蛋白（SP）含量59-60
• 3.6.6 葉綠素含量60-61
• 3.6.7 CAT活性61
• 3.6.8 SOD活性61-62
• 3.6.9 POD活性62-63
• 3.6.10 游離脯氨酸（PRO）含量63-64
• 3.6.11 丙二醛（MDA）含量64
• 3.6.12 相對(duì)電導(dǎo)率（REC）64-65
• 3.7 低溫脅迫對(duì)轉(zhuǎn)HuCAT基因煙草形態(tài)的影響65
• 3.8 低溫脅迫對(duì)生理生化指標(biāo)的影響65-70
• 3.8.1 CAT活性65-66
• 3.8.2 SOD活性66-67
• 3.8.3 POD活性67
• 3.8.4 可溶性糖（SS）含量67-68
• 3.8.5 可溶性蛋白（SP）含量68
• 3.8.6 游離脯氨酸（PRO）含量68-69
• 3.8.7 丙二醛（MDA）含量69-70
• 4 討論70-73
• 4.1 轉(zhuǎn)基因煙草耐逆性的生理生化機(jī)制70-71
• 4.2 HuCAT基因的功能分析71-73
• 5 結(jié)論73-74
• 6 后續(xù)工作展望74-75
• 參考文獻(xiàn)75-82
• 致謝82-83
• 附錄83-84

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本文編號(hào)：1064875