本文關(guān)鍵詞：嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌氟抗性基因crcB的克隆及功能分析

  更多相關(guān)文章： 嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌 抗氟基因 基因克隆 基因表達(dá)

【摘要】：嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌(Acidichiobacillus Ferrooxidans)是一種重要的浸礦微生物,許多礦石中的螢石在酸性浸出環(huán)境下溶出較高濃度的氟離子,嚴(yán)重影響A.ferrooxidans菌的正常代謝及繁殖,從而抑制其在浸礦過程中的效率。因此,高抗氟的優(yōu)良菌株可以有效提高礦石的浸出效率,對(duì)其抗氟的分子機(jī)理的研究利于人們對(duì)優(yōu)良菌株進(jìn)行分子改良,選育出高抗氟的優(yōu)良菌株。根據(jù)已報(bào)道的嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌的基因組,通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),大多數(shù)A.ferrooxidans中也含有細(xì)菌中普遍存在的氟抗性相關(guān)基因crc B基因,已有的研究證明在部分細(xì)菌中crc B基因編碼氟離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白并和細(xì)菌的抗氟特性直接相關(guān),但A.ferrooxidans菌中的crc B基因是否具有相同的作用需要進(jìn)一步驗(yàn)證。我們通過分離純化得到的兩株不同的A.ferrooxidans菌株,一株抗氟,一株不抗氟,分別測(cè)定它們的抗氟能力,結(jié)果顯示不抗氟菌在氟離子濃度為20mg/L的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速率大幅弱于抗氟菌,不抗氟菌在氟離子濃度為60mg/L的培養(yǎng)基中完全不能生長(zhǎng),而抗氟菌仍能生長(zhǎng),但生長(zhǎng)速率有所降低,氟抗性較差的暫定名為A.ferrooxidans BKF,具有較強(qiáng)的氟離子抗性的暫定名為A.ferrooxidans KF。根據(jù)A.ferrooxidans ATCC 23270全基因組序列,設(shè)計(jì)特異引物分別克隆上述兩種菌株的crc B基因。通過PCR克隆獲得A.ferrooxidans KF和A.ferrooxidans BKF菌中的crc B基因的全長(zhǎng)序列。進(jìn)一步進(jìn)行序列比對(duì)和同源建模,獲得了Crc B的理化性質(zhì)及三維結(jié)構(gòu)模型,結(jié)果顯示A.ferrooxidans KF及A.ferrooxidans BKF菌中的Crc B蛋白之間存在三個(gè)氨基酸的差異,且其中第43、44位氨基酸的差異導(dǎo)致蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)發(fā)生一定程度的改變,這些氨基酸的突變可能是導(dǎo)致其Crc B的抗氟相關(guān)功能。通過Real-time Quantitative PCR分析A.ferrooxidans KF在氟脅迫下crc B基因的轉(zhuǎn)錄水平上的變化,結(jié)果顯示相比無氟條件下,A.ferrooxidans KF的crc B基因在含氟條件下(氟離子濃度20mg/L)轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)18倍,初步證明了crc B基因與A.ferrooxidans抗氟過程密切相關(guān)。由于A.ferrooxidans菌中的crc B基因所編碼的是一種逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,構(gòu)建表達(dá)重組質(zhì)粒p ET30a-crc B,轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主感受態(tài)大腸桿菌(E.coli BL21(DE3)),選取經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確后的重組菌在氟條件下誘導(dǎo)表達(dá),以含空載質(zhì)粒的大腸桿菌為對(duì)照,每組設(shè)三個(gè)平行,間隔兩小時(shí)測(cè)OD值,結(jié)果顯示含重組質(zhì)粒p ET30a-crc B的重組菌在含氟培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速度明顯快于對(duì)照組,說明單基因crc B能起一定的抗氟作用。本研究利用生物信息學(xué)分析了抗氟菌株和不抗氟菌株的Crc B的氨基酸序列差異,通過模擬三維結(jié)構(gòu)初步分析了突變點(diǎn)的差異。在轉(zhuǎn)錄水平上分析了抗氟菌株在氟離子下crc B基因的轉(zhuǎn)錄水平上的差異。在大腸桿菌中進(jìn)行了異源表達(dá),分析了crc B基因在大腸桿菌中可以起到一定的抗氟能力。后期將對(duì)兩種菌株進(jìn)行重測(cè)序及轉(zhuǎn)錄組分析,通過分析氟相關(guān)抗性基因的在轉(zhuǎn)錄水平上的差異,系統(tǒng)研究嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌的抗氟的分子機(jī)理。
【關(guān)鍵詞】：嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌 抗氟基因 基因克隆 基因表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：東華理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 第一章 緒論10-24
• 1.1 微生物冶金現(xiàn)狀及發(fā)展10-13
• 1.1.1 微生物冶金簡(jiǎn)介10-11
• 1.1.2 微生物冶金應(yīng)用現(xiàn)狀11-12
• 1.1.3 幾種常見的浸礦微生物12-13
• 1.2 細(xì)菌抗氟研究進(jìn)展13-17
• 1.2.1 氟離子細(xì)菌毒害的作用13-14
• 1.2.2 氟離子殺菌或抑菌的機(jī)制14
• 1.2.3 細(xì)菌抗氟機(jī)制14-17
• 1.2.4 細(xì)菌抗氟研究現(xiàn)狀17
• 1.3 生物信息學(xué)分析17-18
• 1.3.1cDNA序列的分析17-18
• 1.3.2 蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)18
• 1.4 Real-time Quantitative PCR方法簡(jiǎn)介18-20
• 1.4.1 Real-time Quantitative PCR原理介紹18-20
• 1.4.2 Real-time Quantitative PCR反應(yīng)條件優(yōu)化方法20
• 1.5 嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌研究現(xiàn)狀20-21
• 1.5.1 嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌的應(yīng)用21
• 1.5.2 A.ferrooxidans亞鐵氧化系統(tǒng)21
• 1.5.3 A.ferrooxidans硫氧化系統(tǒng)21
• 1.6 研究的目的和意義21-23
• 1.7 實(shí)驗(yàn)流程圖23-24
• 第二章 兩株A.ferrooxidans對(duì)氟離子耐受能力的鑒別24-26
• 2.1 引言24
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料及方法24-25
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)菌株與培養(yǎng)基24
• 2.2.2 EDTA滴定法測(cè)定培養(yǎng)液中的Fe~(2+)的含量方法24-25
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法25
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及結(jié)論25-26
• 第三章 氟抗性相關(guān)基因crcB的測(cè)序、克隆和生物信息學(xué)分析26-48
• 3.1 引言26
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料26-27
• 3.2.1 菌種與質(zhì)粒26
• 3.2.2 主要試劑26
• 3.2.3 主要儀器26
• 3.2.4 培養(yǎng)基26-27
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法27-31
• 3.3.1 A.ferrooxidans菌基因組提取27
• 3.3.2 crcB基因測(cè)序27-30
• 3.3.3 crcB基因的克隆30
• 3.3.4 crcB基因生物信息學(xué)分析30-31
• 3.4 結(jié)果分析31-46
• 3.4.1 crcB基因的克隆31
• 3.4.2 crcB基因測(cè)序結(jié)果對(duì)比分析31-35
• 3.4.3 crcB基因生物信息學(xué)分析35-46
• 3.5 討論46-48
• 第四章 不同氟條件下A.ferrooxidans KF的crcB基因差異表達(dá)48-60
• 4.1 引言48
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料48
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)菌株及試劑48
• 4.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器48
• 4.2.3 培養(yǎng)基及緩沖液48
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法48-53
• 4.3.1 原菌株總RNA提取48-49
• 4.3.2 總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA49
• 4.3.3 兩個(gè)樣本crcB基因表達(dá)量差異測(cè)定49-53
• 4.3.4 Real-time Quantitative PCR數(shù)據(jù)處理53
• 4.4 結(jié)果分析53-59
• 4.4.1 RNA驗(yàn)證53-54
• 4.4.2 確定反應(yīng)退火溫度54-55
• 4.4.3 目的基因及內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線55-59
• 4.4.4 氟離子刺激下A.ferrooxidans KF的crcB基因的差異性表達(dá)59
• 4.5 討論59-60
• 第五章 crcB基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)60-66
• 5.1 引言60
• 5.2 實(shí)驗(yàn)菌種、試劑及儀器60
• 5.2.1 實(shí)驗(yàn)菌種60
• 5.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑60
• 5.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器60
• 5.2.4 培養(yǎng)基及緩沖液60
• 5.3 實(shí)驗(yàn)方法60-63
• 5.3.1 構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒載體pET30a-crcB及導(dǎo)入表達(dá)宿主E.coli BL21DE360-63
• 5.3.2 重組菌抗氟能力檢測(cè)63
• 5.4 結(jié)果分析63-65
• 5.4.1 構(gòu)建重組表達(dá)載體pET30a-crcB63-65
• 5.4.2 重組菌（BL21DE3）抗氟能力檢測(cè)65
• 5.5 討論65-66
• 結(jié)論66-68
• 參考文獻(xiàn)68-74
• 致謝74-75
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文75

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 孫先鋒,郭愛蓮,朱宏莉,張志杰;氧化亞鐵硫桿菌的分離及其生長(zhǎng)條件的研究[J];西北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2000年02期

2 袁欣,袁楚雄,鐘康年,魏以和;非金屬礦物的微生物加工技術(shù)研究(Ⅰ)──氧化亞鐵硫桿菌及其生長(zhǎng)規(guī)律研究[J];中國(guó)非金屬礦工業(yè)導(dǎo)刊;2000年03期

3 秦煜民,張錦瑞;氧化亞鐵硫桿菌在環(huán)境保護(hù)方面的應(yīng)用[J];黃金;2001年03期

4 田克立,林建群,張長(zhǎng)鎧,顏望明;氧化亞鐵硫桿菌鐵氧化系統(tǒng)分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J];微生物學(xué)通報(bào);2002年01期

5 邸進(jìn)申,趙新巧,耿冰;氧化亞鐵硫桿菌分離復(fù)壯及固定化的研究[J];微生物學(xué)報(bào);2003年04期

6 姚靜;徐文靜;李紅玉;;氧化亞鐵硫桿菌馴化菌株的銅離子運(yùn)輸特性[J];中國(guó)有色金屬學(xué)報(bào);2005年12期

7 鄭宇,邸進(jìn)申,劉艷華,李英杰,胡濱;氧化亞鐵硫桿菌培養(yǎng)過程中沉淀的研究[J];生物技術(shù);2005年02期

8 蔣磊;周懷陽;彭曉彤;;廣東云浮硫鐵礦山氧化亞鐵硫桿菌的分離及生長(zhǎng)規(guī)律研究[J];高校地質(zhì)學(xué)報(bào);2006年01期

9 王艷錦;鄭正;周培國(guó);鐘云;彭曉成;;不同培養(yǎng)基中氧化亞鐵硫桿菌生長(zhǎng)及沉淀研究[J];生物技術(shù);2006年04期

10 張?jiān)倮?沈鐳;賈曉珊;;有機(jī)碳源對(duì)氧化亞鐵硫桿菌生長(zhǎng)的影響[J];中山大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2006年06期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 孫東平;吳清杭;周伶俐;;氧化亞鐵硫桿菌發(fā)酵的研究[A];2005年全國(guó)選礦高效節(jié)能技術(shù)及設(shè)備學(xué)術(shù)研討與成果推廣交流會(huì)論文集[C];2005年

2 王娟;;氧化亞鐵硫桿菌浸出九仗溝金礦的研究[A];河南地球科學(xué)通報(bào)2010年卷（下冊(cè)）[C];2010年

3 張哲;黨志;易筱筠;;緩釋抑菌劑對(duì)氧化亞鐵硫桿菌生長(zhǎng)的抑制研究[A];第五屆全國(guó)環(huán)境化學(xué)大會(huì)摘要集[C];2009年

4 李元虎;趙素合;王雅琴;;氧化亞鐵硫桿菌對(duì)廢輪胎胎面膠粉的脫硫再生研究[A];2010年全國(guó)高分子材料科學(xué)與工程研討會(huì)學(xué)術(shù)論文集（下冊(cè)）[C];2010年

5 徐紹霞;向海;陳寧;;海藻酸鈣包埋氧化亞鐵硫桿菌的固定化研究[A];第三屆全國(guó)化學(xué)工程與生物化工年會(huì)論文摘要集（上）[C];2006年

6 吳學(xué)玲;張真真;劉莉莉;鄧凡凡;;重金屬離子對(duì)嗜酸氧化亞鐵硫桿菌菌株活性的影響[A];第五屆全國(guó)微生物資源學(xué)術(shù)暨國(guó)家微生物資源平臺(tái)運(yùn)行服務(wù)研討會(huì)論文摘要集[C];2013年

7 朱艷彬;時(shí)啟立;楊錢華;夏露;柳建設(shè);;嗜酸氧化亞鐵硫桿菌在環(huán)境工程領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀[A];2010中國(guó)環(huán)境科學(xué)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文集(第四卷)[C];2010年

8 熊慧欣;郭榮;;氧化亞鐵硫桿菌作用下四方纖鐵礦的生物礦化形成[A];中國(guó)化學(xué)會(huì)第十二屆膠體與界面化學(xué)會(huì)議論文摘要集[C];2009年

9 姚英杰;張永奎;宋航;盧濤;;氧化亞鐵硫桿菌分解磷礦的實(shí)驗(yàn)研究[A];第一屆全國(guó)化學(xué)工程與生物化工年會(huì)論文摘要集(下)[C];2004年

10 高順枝;羅興章;聶耳;趙國(guó)華;鄭正;陳廣銀;馮景偉;;氧化亞鐵硫桿菌浸銅研究及其胞外多聚物在浸銅中的作用[A];第五屆全國(guó)環(huán)境化學(xué)大會(huì)摘要集[C];2009年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前8條

1 錢林;嗜酸氧化亞鐵硫桿菌鐵硫簇生物合成機(jī)理研究[D];東華大學(xué);2013年

2 劉瑋;具有高的亞鐵氧化活性的氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌構(gòu)建[D];山東大學(xué);2010年

3 南文濱;氧化亞鐵硫桿菌密度感應(yīng)系統(tǒng)功能研究[D];蘭州大學(xué);2011年

4 張燕飛;源自嗜酸氧化亞鐵硫桿菌的硫化物：醌氧化還原酶的特征、結(jié)構(gòu)和機(jī)理研究[D];中南大學(xué);2013年

5 賀治國(guó);氧化亞鐵硫桿菌遺傳多樣性及比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D];中南大學(xué);2005年

6 王玉建;固定化氧化亞鐵硫桿菌生物—化學(xué)兩級(jí)反應(yīng)器系統(tǒng)處理硫化氫[D];蘭州大學(xué);2010年

7 冷非凡;氧化亞鐵硫桿菌和氧化硫硫桿菌對(duì)無機(jī)砷化合物抗性的比較研究[D];蘭州大學(xué);2010年

8 張成桂;嗜酸氧化亞鐵硫桿菌適應(yīng)與活化元素硫的分子機(jī)制研究[D];中南大學(xué);2008年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 唐家彬;高效氧化亞鐵硫桿菌的篩選及脫除SO_2工藝的研究[D];西安工程大學(xué);2015年

2 鄧蓉;氧化亞鐵硫桿菌及其混合菌的浸釩特性及機(jī)理研究[D];湘潭大學(xué);2015年

3 余志波;嗜酸鐵/硫氧化菌在生物浸鈾過程中的協(xié)同作用研究[D];東華理工大學(xué);2016年

4 張鵬華;嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌氟抗性基因crcB的克隆及功能分析[D];東華理工大學(xué);2016年

5 謝明;9株嗜酸氧化亞鐵硫桿菌的分離篩選及分子多樣性研究[D];中南大學(xué);2009年

6 張赫;氧化亞鐵硫桿菌脫除二氧化硫的應(yīng)用研究[D];蘭州大學(xué);2012年

7 姚英杰;氧化亞鐵硫桿菌分解難處理金礦的研究[D];四川大學(xué);2005年

8 何凱宇;中國(guó)礦區(qū)氧化亞鐵硫桿菌的篩選及金屬和有機(jī)物抗性研究[D];蘭州大學(xué);2006年

9 李慶華;嗜酸氧化亞鐵硫桿菌細(xì)胞壁相關(guān)蛋白表達(dá)圖譜的構(gòu)建[D];中南大學(xué);2008年

10 馮光志;高活性高抗性氧化亞鐵硫桿菌的選育及其在銅礦浸出中的應(yīng)用[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

，

本文編號(hào)：1062820