本文關(guān)鍵詞：番茄SlWHY2基因的克隆、表達(dá)和功能分析

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【摘要】：植物在整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中,不可避免的會(huì)受到來(lái)自外界環(huán)境因子的各種刺激,如干旱、鹽漬和低溫等非生物脅迫及病蟲(chóng)侵害等。植物自身在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了抵抗各種生物脅迫和非生物脅迫的防御機(jī)制。干旱脅迫作為我國(guó)北方地區(qū)常見(jiàn)的非生物脅迫,影響番茄的生長(zhǎng)發(fā)育,表現(xiàn)在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理和生化方面的變化,最終造成減產(chǎn)。此外,病蟲(chóng)侵害也是影響番茄正常生長(zhǎng)發(fā)育的因素之一。WHIRLY轉(zhuǎn)錄因子作為植物體內(nèi)特有的一類轉(zhuǎn)錄因子,可以通過(guò)響應(yīng)干旱及病害的刺激,調(diào)控編碼不同抗氧化酶基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控酶活性,調(diào)控脅迫相關(guān)基因及抗病相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)植物的抗旱性和抗病性。在本試驗(yàn)中克隆得到番茄WHIRLY轉(zhuǎn)錄因子SlWHY2基因,以轉(zhuǎn)基因煙草作為試驗(yàn)材料,研究了SlWHY2轉(zhuǎn)基因煙草在干旱脅迫下對(duì)活性氧的清除能力及其在抗病等方面的影響。本試驗(yàn)主要結(jié)果如下:(1)據(jù)NCBI得到該轉(zhuǎn)錄因子的mRNA序列,GenBank編碼號(hào):XM_010314783。SlWHY2全長(zhǎng)1162bp,開(kāi)放閱讀框?yàn)?26bp,編碼241個(gè)氨基酸。(2)利用qRT-PCR對(duì)SlWHY2在番茄中表達(dá)特性分析表明,SlWHY2基因在葉片中的表達(dá)量高于其他組織;轉(zhuǎn)錄水平受聚乙二醇,氯化鈉,水楊酸和過(guò)氧化氫的誘導(dǎo)表達(dá)。此外,SlWHY2的表達(dá)還受到青枯假單胞菌的誘導(dǎo)。(3)構(gòu)建了SlWHY2的pBI121載體,轉(zhuǎn)化野生型煙草,獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株,通過(guò)PCR和qRT-PCR的方法篩選過(guò)表達(dá)植株,從中選取不同表達(dá)量的三個(gè)株系(OE-1,OE-3,OE-5)作為后續(xù)試驗(yàn)材料。(4)在正常的生長(zhǎng)條件下,野生型與轉(zhuǎn)基因煙草植株表型無(wú)明顯差異。在干旱脅迫條件下,轉(zhuǎn)基因株系幼苗及成苗的生長(zhǎng)狀態(tài)要優(yōu)于野生型。DAB、NBT染色結(jié)果顯示,干旱處理后,野生型葉片顏色深于轉(zhuǎn)基因煙草,H2O2和O2·-含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)一步表明野生型煙草的活性氧積累量高于轉(zhuǎn)基因煙草,且轉(zhuǎn)基因煙草的酶活性及相關(guān)酶基因表達(dá)水平均高于野生型。這說(shuō)明SlWHY2過(guò)表達(dá)提高了煙草抗氧化能力,緩解活性氧對(duì)植株的氧化毒害作用。(5)測(cè)定干旱處理后轉(zhuǎn)基因煙草和野生型葉片的相對(duì)含水量、相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛以及游離脯氨酸的含量,結(jié)果表明野生型植株的相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛含量明顯高于轉(zhuǎn)基因株系,而相對(duì)含水量和游離脯氨酸含量則低于轉(zhuǎn)基因煙草。試驗(yàn)進(jìn)一步說(shuō)明過(guò)表達(dá)SlWHY2提高煙草的抗?jié)B透脅迫能力。(6)用青枯假單胞菌分別噴施、注射過(guò)表達(dá)和野生型煙草后,通過(guò)DAB和臺(tái)盼藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草過(guò)氧化氫積累量及細(xì)胞死亡數(shù)均低于野生型煙草,通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)病程相關(guān)基因(PR1和PR2)表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)水平明顯高于野生型煙草。說(shuō)明過(guò)表達(dá)SlWHY2煙草可能通過(guò)水楊酸依賴途徑提高對(duì)活體病原菌的抗性。
【關(guān)鍵詞】：轉(zhuǎn)基因煙草 SlWHY2 干旱脅迫 抗病 活性氧
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q943.2;S641.2
【目錄】：

• 符號(hào)說(shuō)明4-8
• 中文摘要8-10
• Abstract10-12
• 1 前言12-22
• 1.1 干旱對(duì)植物的傷害12-13
• 1.1.1 干旱對(duì)植物生物膜系統(tǒng)的影響12
• 1.1.2 干旱脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)的影響12-13
• 1.1.3 干旱對(duì)植物代謝的影響13
• 1.2 抗旱生理機(jī)制13-15
• 1.2.1 活性氧產(chǎn)生及抗氧化系統(tǒng)的作用13-15
• 1.2.2 滲透調(diào)節(jié)15
• 1.3 WHIRLY轉(zhuǎn)錄因子研究進(jìn)展15-20
• 1.3.1 WHIRLY蛋白分子結(jié)構(gòu)16
• 1.3.2 WHIRLY蛋白晶體結(jié)構(gòu)16-17
• 1.3.3 WHIRLY轉(zhuǎn)錄因子在植物中的分布17-18
• 1.3.4 WHIRLY蛋白功能18-20
• 1.4 本研究的目的意義20-22
• 2 材料與方法22-38
• 2.1 試驗(yàn)材料22-25
• 2.1.1 植物材料22
• 2.1.2 材料處理22
• 2.1.3 菌株與載體22
• 2.1.4 酶與各種生化試劑22-23
• 2.1.5 PCR引物23-24
• 2.1.6 營(yíng)養(yǎng)液和培養(yǎng)基配方24-25
• 2.2 試驗(yàn)方法25-38
• 2.2.1 植物總RNA的提取25-26
• 2.2.2 c DNA第一條鏈的合成26
• 2.2.3 番茄Sl WHY2基因的克隆26-27
• 2.2.4 目的片段的回收27-28
• 2.2.5 真核表達(dá)載體構(gòu)建28-31
• 2.2.5.1 正義克隆載體構(gòu)建28
• 2.2.5.2 大腸桿菌DH5α 感受態(tài)的制備28-29
• 2.2.5.3 轉(zhuǎn)化及克隆篩選29
• 2.2.5.4 大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取29-30
• 2.2.5.5 正義表達(dá)載體構(gòu)建30
• 2.2.5.6 根癌農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞制備30-31
• 2.2.5.7 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化31
• 2.2.6 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草轉(zhuǎn)化31-32
• 2.2.7 轉(zhuǎn)基因煙草植株的PCR檢測(cè)32-34
• 2.2.7.1 CTAB法提取葉片基因組DNA32
• 2.2.7.2 過(guò)表達(dá)植株的PCR篩選32-33
• 2.2.7.3 轉(zhuǎn)錄水平的鑒定33
• 2.2.7.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR33-34
• 2.2.8 轉(zhuǎn)基因株系的抗逆試驗(yàn)34
• 2.2.8.1 煙草抗干旱萌發(fā)試驗(yàn)34
• 2.2.8.2 煙草幼苗干旱脅迫處理34
• 2.2.8.3 煙草成苗脅迫處理34
• 2.2.9 生理指標(biāo)測(cè)定34-38
• 2.2.9.1 酶活性測(cè)定34-35
• 2.2.9.2 氧自由基的測(cè)定35
• 2.2.9.3 過(guò)氧化氫含量測(cè)定35-36
• 2.2.9.4 葉片相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定36
• 2.2.9.5 葉片相對(duì)含水量測(cè)定36
• 2.2.9.6 植物組織中丙二醛含量的測(cè)定36
• 2.2.9.7 植物組織中游離脯氨酸含量測(cè)定36-37
• 2.2.9.8 NBT、DAB染色和臺(tái)盼藍(lán)染色37
• 2.2.9.9 植物對(duì)病原菌的抗性分析37-38
• 3 結(jié)果與分析38-51
• 3.1 SlWHY2基因的分離和結(jié)構(gòu)特征38-40
• 3.1.1 SlWHY2基因的克隆38
• 3.1.2 SlWHY2基因序列分析38-40
• 3.2 SlWHY2基因在番茄中的表達(dá)分析40-41
• 3.2.1 SlWHY2基因組織特異性表達(dá)40-41
• 3.2.2 SlWHY2基因在不同脅迫條件下的表達(dá)分析41
• 3.3 SlWHY2正義表達(dá)載體的構(gòu)建41-42
• 3.4 SlWHY2基因在煙草中的遺傳轉(zhuǎn)化42-44
• 3.5 SlWHY2過(guò)表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱性44-49
• 3.5.1 SlWHY2轉(zhuǎn)基因煙草在干旱脅迫條件下的生長(zhǎng)分析44-45
• 3.5.2 SlWHY2轉(zhuǎn)基因煙草在干旱條件下的生理指標(biāo)的變化45-46
• 3.5.3 SlWHY2轉(zhuǎn)基因煙草植株積累較少的ROS46-48
• 3.5.4 SlWHY2過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因煙草中應(yīng)激防御基因的表達(dá)48-49
• 3.6 Sl WHY2過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因煙草的抗病性49-51
• 4 討論51-54
• 5 結(jié)論54-55
• 參考文獻(xiàn)55-64
• 致謝64-65
• 碩士期間發(fā)表論文情況65

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1 徐宜民,時(shí)焦;轉(zhuǎn)基因煙草與生物制藥[J];世界農(nóng)業(yè);2002年07期

2 汪開(kāi)治;利用轉(zhuǎn)基因煙草消除黃色炸藥梯恩梯的環(huán)境污染[J];生物技術(shù)通報(bào);2004年01期

3 郭兆奎,顏培強(qiáng),萬(wàn)秀清,李麗杰,楊謙;轉(zhuǎn)基因煙草熒光定量檢測(cè)方法研究[J];中國(guó)生物工程雜志;2005年01期

4 王逸群,鄭金貴,謝寶貴;轉(zhuǎn)基因煙草中賴氨酸含量的提高[J];應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào);2005年01期

5 王悅琳;李德全;;耐鹽基因及轉(zhuǎn)基因煙草研究進(jìn)展[J];生物技術(shù)通報(bào);2009年10期

6 劉俊君,黃紹興,彭學(xué)賢,柳維波,王海云;高度耐鹽雙價(jià)轉(zhuǎn)基因煙草的研究[J];生物工程學(xué)報(bào);1995年04期

7 劉俊君,王海云,黃紹興,柳維波;轉(zhuǎn)基因煙草的甘露醇合成和耐鹽性[J];生物工程學(xué)報(bào);1996年02期

8 王萬(wàn)軍，王文芳，曹建軍，白守信;轉(zhuǎn)基因煙草的大田抗病性分析[J];西北植物學(xué)報(bào);1999年02期

9 劉春明,朱禎,周兆斕,孫寶林,馮平章,李向輝;豇豆胰蛋白酶抑制劑抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因煙草的獲得[J];科學(xué)通報(bào);1992年18期

10 方榮祥,田穎川,王桂玲,許丙寅,李太元,莽克強(qiáng),張振臣,吳青,周汝鴻,王鳳龍,史萬(wàn)華,韓曉東;雙抗轉(zhuǎn)基因煙草純合系的選育及田間試驗(yàn)[J];中國(guó)科學(xué)(B輯 化學(xué) 生命科學(xué) 地學(xué));1993年05期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 戴秀玉;周堅(jiān);楊波;;高效液相分離/蒸發(fā)光散射檢測(cè)測(cè)定轉(zhuǎn)基因煙草中的海藻糖[A];新世紀(jì) 新機(jī)遇 新挑戰(zhàn)——知識(shí)創(chuàng)新和高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展（上冊(cè)）[C];2001年

2 李天飛;閆新甫;李文正;劉勇;;轉(zhuǎn)基因煙草安全性與入世后面臨的挑戰(zhàn)[A];加入WTO和中國(guó)科技與可持續(xù)發(fā)展——挑戰(zhàn)與機(jī)遇、責(zé)任和對(duì)策（上冊(cè)）[C];2002年

3 陳英;王義琴;孫勇如;黃敏仁;王明庥;;雙價(jià)抗病基因表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因煙草的獲得[A];持續(xù)發(fā)展，，再創(chuàng)輝煌——中國(guó)林學(xué)會(huì)林木遺傳育種分會(huì)第五屆年會(huì)文集[C];2002年

4 申海燕;王花紅;王紅;劉本葉;李國(guó)鳳;葉和春;;利用轉(zhuǎn)基因煙草合成青蒿素前體的研究[A];中國(guó)植物學(xué)會(huì)七十五周年年會(huì)論文摘要匯編（1933-2008）[C];2008年

5 王鳳德;劉家堯;王海慶;張洪霞;;過(guò)氧化氫酶的克隆和轉(zhuǎn)基因煙草的獲得[A];2005年全國(guó)植物逆境生理與分子生物學(xué)研討會(huì)論文摘要匯編[C];2005年

6 夏妍;王娟;齊穎;王桂萍;張紅生;沈振國(guó);;表達(dá)海州香薷金屬硫蛋白提高煙草銅耐性及鎘轉(zhuǎn)運(yùn)能力[A];中國(guó)植物生理學(xué)會(huì)第十次會(huì)員代表大會(huì)暨全國(guó)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要匯編[C];2009年

7 段曉光;高峰;楊愛(ài)芳;張舉仁;;轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞水平耐鹽性差異的比較分析[A];中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)2005年學(xué)術(shù)大會(huì)、青年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2005年

8 張萌;王鑫;王瑋;;不同啟動(dòng)子過(guò)表達(dá)小麥泛素基因TaUB2對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草表型及抗逆性的影響[A];山東植物生理學(xué)會(huì)第七次代表大會(huì)暨植物生物學(xué)與現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研討會(huì)論文集[C];2012年

9 陳大清;莫瑩;王建;李亞男;;SMT和AtCpNifS超表達(dá)對(duì)離體煙草葉片硒脅迫耐受的響應(yīng)機(jī)制分析[A];2013全國(guó)植物生物學(xué)大會(huì)論文集[C];2013年

10 李海燕;李小雙;楊紅蘭;張道遠(yuǎn);;EsDREB基因過(guò)表達(dá)提高轉(zhuǎn)基因煙草抗逆性[A];生態(tài)文明建設(shè)中的植物學(xué)：現(xiàn)在與未來(lái)——中國(guó)植物學(xué)會(huì)第十五屆會(huì)員代表大會(huì)暨八十周年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集——第3分會(huì)場(chǎng)：植物分子生物學(xué)與基因組學(xué)[C];2013年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前6條

1 記者 姜海;轉(zhuǎn)基因煙草有了新用途[N];科技日?qǐng)?bào);2007年

2 編譯 時(shí)焦;轉(zhuǎn)基因煙草可消除環(huán)境中的綠藻毒素[N];東方煙草報(bào);2010年

3 ;我國(guó)培育出耐鹽轉(zhuǎn)基因煙草[N];今日信息報(bào);2004年

4 ;轉(zhuǎn)基因煙草“長(zhǎng)出”狂犬病抗體[N];大眾科技報(bào);2003年

5 記者 欒海;大腸桿菌妙用[N];新華每日電訊;2002年

6 荷丹;中國(guó)煙展吸引眾多外商[N];廠長(zhǎng)經(jīng)理日?qǐng)?bào);2000年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 吳電云;枸杞LcMKK及LchERF基因的分離及抗逆功能分析[D];天津大學(xué);2015年

2 張麗青;嗜熱毛殼菌超氧化物歧化酶基因的克隆、表達(dá)及轉(zhuǎn)基因煙草耐鹽性研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

3 呂軍;轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)土壤磷吸收利用的研究[D];大連理工大學(xué);2011年

4 成妮妮;α-法尼烯合酶過(guò)表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草生長(zhǎng)發(fā)育的影響及其基因啟動(dòng)子的克隆與功能分析[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

5 胡瓊;dsRNA介導(dǎo)的煙草和番茄抗病毒基因工程研究[D];浙江大學(xué);2010年

6 宋莉;ChIFN-α基因遺傳轉(zhuǎn)化植物及提高煙草抗病毒能力的研究[D];貴州大學(xué);2009年

7 魯黎明;AtCIPK23在煙草中過(guò)表達(dá)的鉀效率響應(yīng)及NtHAK1的克隆與表達(dá)模式研究[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

8 蘭玉菲;兩種抗病毒策略介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因研究和煙草脈帶花葉病毒蛋白的表達(dá)[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

9 張付云;殼寡糖誘導(dǎo)煙草抗性相關(guān)基因的克隆和鑒定[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院（大連化學(xué)物理研究所）;2007年

10 付宏歧;利用轉(zhuǎn)基因煙草和紅花表達(dá)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21（FGF21）的研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 周升恩;PP1c基因在植物應(yīng)答甲醛脅迫中的作用機(jī)理研究[D];昆明理工大學(xué);2015年

2 閆文慧;轉(zhuǎn)基因煙草連作對(duì)紫色土根際微生態(tài)環(huán)境的影響[D];西南大學(xué);2015年

3 趙玉宇;白沙蒿的抗冷性及其△12脂肪酸脫氫酶基因轉(zhuǎn)化煙草的研究[D];蘭州大學(xué);2012年

4 孔祥柱;干旱誘導(dǎo)小麥F-box蛋白基因TαFBA1表達(dá)提高轉(zhuǎn)基因煙草抗旱性的研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

5 李樹(shù)珍;轉(zhuǎn)黃瓜CsPLDα基因煙草幼苗對(duì)鹽和干旱脅迫的抗性研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

6 余丹;PtFT基因不同轉(zhuǎn)錄本異位表達(dá)表型鑒定及嫁接信號(hào)轉(zhuǎn)移[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

7 李文娟;GbMYB5基因在棉花耐干旱脅迫中的功能研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

8 王翠;轉(zhuǎn)popW基因煙草的鑒定及其抗病抗氧化分析[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

9 易嘉;14-3-3蛋白和質(zhì)膜H~+-ATPase表達(dá)改變轉(zhuǎn)基因煙草應(yīng)答干旱脅迫的分子機(jī)制[D];昆明理工大學(xué);2014年

10 王歡;黃花苜蓿MfDREB1轉(zhuǎn)錄因子在提高轉(zhuǎn)基因煙草抗逆性中的作用研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2016年

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