發(fā)布時間：2017-10-17 21:20

  本文關(guān)鍵詞：棉花轉(zhuǎn)錄因子基因GhWRKY27a的分離及功能研究

  更多相關(guān)文章： 棉花 WRKY轉(zhuǎn)錄因子 干旱脅迫 立枯絲核菌侵染 脫落酸 活性氧

【摘要】：棉花是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物,但其產(chǎn)量和品質(zhì)常受干旱、低溫、鹽堿以及病原菌侵染等多種逆境脅迫的影響。為了適應(yīng)和抵御這些逆境脅迫,植物在長期進(jìn)化的過程中,逐漸形成了一系列復(fù)雜的防御反應(yīng)機(jī)制。其中,轉(zhuǎn)錄因子在這些防衛(wèi)反應(yīng)中起到了十分重要的作用。WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子,不僅參與調(diào)控植物的生長發(fā)育、衰老及物質(zhì)代謝等一系列生理過程,還廣泛參與植物對各種生物及非生物脅迫的應(yīng)答過程。然而,相對于Ⅰ類和Ⅱ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子,關(guān)于Ⅲ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子生物學(xué)功能的研究仍較少。在本研究中,我們從棉花中分離得到一個Ⅲ類WRKY基因,命名為Gh WRKY27a,并對其在生物和非生物脅迫反應(yīng)中的表達(dá)特性及生物學(xué)功能進(jìn)行了一系列研究。具體結(jié)果如下:(1)Gh WRKY27a的c DNA序列全長為1513bp,包含1068bp的開放閱讀框(ORF)、319bp的5'非編碼區(qū)和126bp的3'非編碼區(qū)。ORF編碼一個含有356個氨基酸殘基的多肽,預(yù)測其分子量為40.062k Da,p I值為5.46。氨基酸序列比對以及聚類分析表明,Gh WRKY27a屬于第Ⅲ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子。亞細(xì)胞定位分析結(jié)果表明Gh WRKY27a定位在細(xì)胞核中。(2)利用Plant CARE和PLACE數(shù)據(jù)庫對Gh WRKY27a的啟動子序列進(jìn)行分析,得到一系列與脅迫應(yīng)答相關(guān)的順式作用元件。進(jìn)一步對Gh WRKY27a的表達(dá)特性進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)Gh WRKY27a的表達(dá)可受干旱、高鹽和低溫等非生物脅迫,過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)、脫落酸(abscisic acid,ABA)、水楊酸(salicylic acid,SA)、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,Me JA)、乙烯(ethylene,ET)等信號分子及立枯絲核菌(Rhizoctonia solani,R.solani)的誘導(dǎo)。(3)利用病毒介導(dǎo)的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技術(shù),獲得棉花Gh WRKY27a沉默植株。通過對其進(jìn)行抗旱性檢測,發(fā)現(xiàn)Gh WRKY27a的沉默能夠提高植株對干旱脅迫的耐受力。此外,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化本生煙,獲得Gh WRKY27a超表達(dá)植株。Gh WRKY27a超表達(dá)植株對干旱脅迫十分敏感,且超表達(dá)植株的葉片具有較高的失水率。以上結(jié)果表明,Gh WRKY27a在植物對干旱脅迫的應(yīng)答反應(yīng)中起負(fù)調(diào)控作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),Gh WRKY27a的超表達(dá)能夠抑制轉(zhuǎn)基因植株干旱誘導(dǎo)的ABA累積,且破壞ABA介導(dǎo)的氣孔關(guān)閉。(4)Gh WRKY27a超表達(dá)植株接種R.solani后,轉(zhuǎn)基因植株比野生型植株具有更嚴(yán)重的發(fā)病表型。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),超表達(dá)Gh WRKY27a改變了轉(zhuǎn)基因植株中防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)量。由此推測,Gh WRKY27a可能在植物應(yīng)對R.solani的侵染中起負(fù)調(diào)控作用。(5)在干旱脅迫和R.solani侵染后,我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株比野生型植株積累更多的活性氧,且抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)水平降低。此外,轉(zhuǎn)基因植株降低了對氧化脅迫的耐受性。這表明Gh WRKY27a可能通過增加活性氧的積累,增強(qiáng)對逆境脅迫的敏感性。
【關(guān)鍵詞】：棉花 WRKY轉(zhuǎn)錄因子 干旱脅迫 立枯絲核菌侵染 脫落酸 活性氧
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2;S562
【目錄】：

• 符號說明4-9
• 中文摘要9-11
• Abstract11-13
• 1 前言13-23
• 1.1 轉(zhuǎn)錄因子13-14
• 1.2 WRKY轉(zhuǎn)錄因子的起源與進(jìn)化14-15
• 1.3 WRKY轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)15-17
• 1.4 WRKY轉(zhuǎn)錄因子的分類17
• 1.5 WRKY轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)功能17-22
• 1.5.1 WRKY轉(zhuǎn)錄因子與非生物脅迫18-20
• 1.5.2 WRKY轉(zhuǎn)錄因子與生物脅迫20-22
• 1.5.3 WRKY轉(zhuǎn)錄因子與活性氧22
• 1.6 本研究的目的及意義22-23
• 2 材料與方法23-44
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料23-25
• 2.1.1 植物材料23
• 2.1.2 菌株與載體23
• 2.1.3 其他材料23
• 2.1.4 PCR引物23-25
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法25-44
• 2.2.1 棉花材料的培養(yǎng)及處理25-26
• 2.2.2 植物總RNA的提取26-28
• 2.2.2.1 CTAB法提取棉花植株總RNA26-27
• 2.2.2.2 利用試劑盒法快速提取棉花總RNA27
• 2.2.2.3 利用Trizol Kit提取煙草總RNA27-28
• 2.2.3 cDNA第一鏈的合成28
• 2.2.4 cDNA的純化和加尾反應(yīng)28-29
• 2.2.4.1 cDNA的純化28-29
• 2.2.4.2 cDNA 5′末端加尾反應(yīng)29
• 2.2.5 GhWRKY27a全長cDNA序列的獲得29-32
• 2.2.5.1 GhWRKY27a中間片段的獲得29-30
• 2.2.5.2 5'RACE獲得 5'端序列30-31
• 2.2.5.3 3'RACE獲得 3'端序列31-32
• 2.2.5.4 cDNA全長序列的獲得32
• 2.2.6 植物基因組DNA的提取和純化32-33
• 2.2.7 GhWRKY27a全長基因組序列的獲取33-34
• 2.2.8 GhWRKY27a啟動子序列的獲得34
• 2.2.9 目的片段的回收34-35
• 2.2.10 目的片段與克隆載體的連接35
• 2.2.11 大腸桿菌超級感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化35-36
• 2.2.11.1 Inoue法制備大腸桿菌超級感受態(tài)細(xì)胞35-36
• 2.2.11.2 大腸桿菌超級感受態(tài)細(xì)胞DH5α的轉(zhuǎn)化36
• 2.2.12 大腸桿菌質(zhì)粒的提取36
• 2.2.13 重組質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證36-37
• 2.2.14 實(shí)時熒光定量PCR檢測目的基因的表達(dá)量37-38
• 2.2.15 植物表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化38-39
• 2.2.15.1 植物表達(dá)載體的構(gòu)建38
• 2.2.15.2 制備農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞38-39
• 2.2.15.3 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化39
• 2.2.15.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時侵染39
• 2.2.16 棉花VIGS沉默植株的獲得39-40
• 2.2.17 GhWRKY27a超表達(dá)植株的獲得40-41
• 2.2.17.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化本生煙40
• 2.2.17.2 小量法提取煙草植株基因組DNA40-41
• 2.2.17.3 轉(zhuǎn)基因煙草植株的鑒定41
• 2.2.18 轉(zhuǎn)基因煙草滲透脅迫下的萌發(fā)率和根長測定41
• 2.2.19 干旱實(shí)驗(yàn)41
• 2.2.20 葉片失水率測定41-42
• 2.2.21 氣孔開度測定42
• 2.2.22 ABA濃度測定42
• 2.2.23 氧化脅迫實(shí)驗(yàn)42
• 2.2.24 轉(zhuǎn)基因植株的抗病分析42-43
• 2.2.24.1 PDA培養(yǎng)基的配制42
• 2.2.24.2 病原菌的活化42
• 2.2.24.3 病原菌的離體接種42-43
• 2.2.24.4 病原菌的活體接種43
• 2.2.25 組織化學(xué)染色分析43
• 2.2.25.1 3, 3'-二氨基聯(lián)苯胺（3, 3'-diaminobenzidine, DAB）染色43
• 2.2.25.2 氮藍(lán)四唑（nitroblue tetrazolium, NBT）染色43
• 2.2.26 網(wǎng)絡(luò)信息資源43
• 2.2.27 生物學(xué)軟件43-44
• 3 結(jié)果與分析44-67
• 3.1 棉花GhWRKY27a基因的分離44-48
• 3.1.1 GhWRKY27a中間片段的分離44
• 3.1.2 GhWRKY27a 5'片段和 3'片段的分離44-45
• 3.1.3 GhWRKY27a全長cDNA序列的分離45-46
• 3.1.4 GhWRKY27a全長cDNA序列分析46
• 3.1.5 GhWRKY27a氨基酸序列分析及其進(jìn)化分析46-48
• 3.2 GhWRKY27a基因組序列的分離及分析48-49
• 3.3 棉花GhWRKY27a的亞細(xì)胞定位分析49-50
• 3.4 GhWRKY27a啟動子序列的分離及其順式作用元件的預(yù)測50-51
• 3.5 GhWRKY27a的表達(dá)模式分析51-54
• 3.5.1 GhWRKY27a的組織特異性分析51-52
• 3.5.2 GhWRKY27a在非生物脅迫下的表達(dá)模式52
• 3.5.3 GhWRKY27a在生物脅迫下的表達(dá)特性分析52
• 3.5.4 GhWRKY27a在多種信號分子處理下的表達(dá)模式52-54
• 3.6 GhWRKY27a沉默植株的獲得及鑒定54-55
• 3.6.1 GhWRKY27a沉默載體的構(gòu)建54
• 3.6.2 GhWRKY27a沉默植株的獲得54-55
• 3.7 棉花GhWRKY27a沉默植株對干旱脅迫的抗性分析55-56
• 3.8 GhWRKY27a超表達(dá)植株的獲得及鑒定56-58
• 3.8.1 GhWRKY27a超表達(dá)植株的獲得56
• 3.8.2 GhWRKY27a超表達(dá)植株的鑒定56-58
• 3.9 GhWRKY27a超表達(dá)植株對干旱脅迫的抗性分析58-64
• 3.9.1 GhWRKY27a超表達(dá)植株對甘露醇引起的滲透脅迫的敏感性58-59
• 3.9.2 GhWRKY27a超表達(dá)植株對干旱脅迫的敏感性59-61
• 3.9.3 GhWRKY27a超表達(dá)植株對ABA不敏感61-62
• 3.9.4 超表達(dá)GhWRKY27a降低了轉(zhuǎn)基因植株的抗氧化能力62-64
• 3.10 GhWRKY27a超表達(dá)植株對立枯絲核菌的抗性分析64-67
• 3.10.1 GhWRKY27a超表達(dá)植株對立枯絲核菌侵染的敏感性64
• 3.10.2 GhWRKY27a超表達(dá)植株在立枯絲核菌侵染下增加了活性氧的積累64-65
• 3.10.3 GhWRKY27a超表達(dá)植株在立枯絲核菌侵染下抗性相關(guān)基因的表達(dá)水平65-67
• 4 討論67-71
• 4.1 GhWRKY27a屬于Ⅲ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子67
• 4.2 GhWRKY27a的亞細(xì)胞定位分析67-68
• 4.3 GhWRKY27a的表達(dá)受多種逆境脅迫及信號分子的誘導(dǎo)68
• 4.4 GhWRKY27a參與調(diào)控干旱脅迫反應(yīng)68-69
• 4.5 GhWRKY27a參與調(diào)控抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑69-71
• 5 結(jié)論71-72
• 參考文獻(xiàn)72-79
• 致謝79-80
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況80

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