本文關(guān)鍵詞：一種新型硫酸軟骨素AC外切酶的基因克隆及其催化特性研究

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【摘要】：糖胺聚糖(glycosaminoglycans, GAGs)是一類在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用的多糖,并且與多種疾病息息相關(guān)。硫酸軟骨素AC外切酶(chondroitin sulfate AC lyase, ChnAC, EC 4.2.2.5)可以降解包括硫酸軟骨素(chondroitin sulfate, CS)和透明質(zhì)酸(hyaluronic acid, HA)在內(nèi)的多種GAGs,生成非還原端包含4-不飽和葡糖醛酸的相應(yīng)二糖。研究發(fā)現(xiàn),多種野生微生物可以表達ChnAC,這些酶的編碼基因大部分已經(jīng)確定。天然或者重組表達的微生物來源的ChnAC作為降解工具酶被并廣泛的應(yīng)用于GAGs糖鏈結(jié)構(gòu)研究和序列分析。本課題的主要內(nèi)容包括：1.本課題組此前從土壤中篩選到一株高產(chǎn)硫酸軟骨素降解酶(chondroitin sulfate lyase, ChSase)的節(jié)桿菌屬(Arthrobacter sp.)菌株SSAs-1。通過分子生物學(xué)手段克隆該菌株表達ChSase的編碼基因AsChnAC.首先設(shè)計簡并引物,PCR擴增得到中間部分基因序列；然后通過inverse PCR方法得到下游基因序列；通過Genome Walking技術(shù)得到上游基因序列；最后序列分析確定該基因起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAG),確定編碼ChSase的基因序列的開放閱讀框架。2.實現(xiàn)AsChnAC基因在大腸桿菌表達系統(tǒng)中高效重組表達,并優(yōu)化了該基因編碼的蛋白的誘導(dǎo)和純化條件。3.通過氨基酸殘基序列同源比對分析和純化酶分子底物特異性分析,確定本課題自節(jié)桿菌SSAs-1克隆獲得的ChSase為硫酸軟骨素AC外切酶ChnAC,并命名為AsChnAC。4.系統(tǒng)分析了該新型AsChnAC的酶學(xué)參數(shù),以化學(xué)酶法合成的結(jié)構(gòu)確定的寡糖系列底物首次確定了ChSase對底物糖鏈的酶解方向。盡管微生物ChnAC的底物特異性和蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)已有一定的研究基礎(chǔ),但由于結(jié)構(gòu)均一確定模式底物的缺乏,使其降解糖鏈的催化方向性仍然未知。本課題首次利用化學(xué)酶法寡糖合成技術(shù)制備了四種肝素-軟骨素嵌合寡糖底物,通過電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)技術(shù)分析了AsChnAC處理四種寡糖的降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。實驗結(jié)果表明,AsChnAC可以降解位于底物寡糖糖鏈還原端的-GalNAc-β1,4-GlcA-單位；然而當-GlcNAc-α14-GlcA-單位位于寡糖糖鏈的還原端時,卻阻礙了AsChnAC降解寡糖糖鏈中間和非還原端的-GalNAc-β1,4-GlcA-單位。上述實驗結(jié)果直接證明了ChnAC對底物的催化方向為從還原端向非還原端降解。本課題的結(jié)論深化了我們對AsChnAC催化模式的認識,對了解微生物來源的糖胺聚糖分解酶的研究具有重要的科學(xué)理論意義,而且相關(guān)成果可以直接指導(dǎo)AsChnAC在GAG結(jié)構(gòu)分析、低分子量GAG制備等領(lǐng)域的應(yīng)用,也為未來對該酶分子的定向進化獲得功能特定突變體提供了理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：糖胺聚糖 硫酸軟骨素 硫酸軟骨素AC外切酶 模式底物 催化方向
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q78;R91
【目錄】：

• 摘要10-12
• ABSTRACTS12-14
• 符號說明14-16
• 第一章 前言16-23
• 1.1 硫酸軟骨素16-18
• 1.1.1 糖胺聚糖16-17
• 1.1.2 硫酸軟骨素的結(jié)構(gòu)17
• 1.1.3 硫酸軟骨素的應(yīng)用17-18
• 1.2 硫酸軟骨素降解酶18-20
• 1.2.1 糖胺聚糖降解酶18
• 1.2.2 硫酸軟骨素降解酶的分類18
• 1.2.3 硫酸軟骨素AC降解酶18-19
• 1.2.4 硫酸軟骨素降解酶的應(yīng)用19-20
• 1.2.5 硫酸軟骨素降解酶的基因克隆和重組表達20
• 1.3 本實驗的研究內(nèi)容與意義20-23
• 1.3.1 編碼硫酸軟骨素降解酶未知基因序列的擴增20-21
• 1.3.2 新型硫酸軟骨素降解酶的異源表達與純化21
• 1.3.3 硫酸軟骨素AC降解酶催化方向研究21-22
• 1.3.4 研究意義22-23
• 第二章 新型硫酸軟骨素降解酶編碼基因的擴增23-35
• 2.1 實驗儀器、材料與試劑23
• 2.1.1 實驗儀器23
• 2.1.2 材料與試劑23
• 2.2 實驗方法23-28
• 2.2.1 菌株全基因組提取24
• 2.2.2 設(shè)計簡并引物擴增部分目的基因24-25
• 2.2.3 利用反向PCR擴增下游基因序列25-26
• 2.2.4 應(yīng)用Genome walking技術(shù)克隆剩余基因序列26-28
• 2.2.5 擴增全部目的基因28
• 2.3 實驗結(jié)果28-33
• 2.3.1 中間部分目的基因的擴增29-30
• 2.3.2 下游目的基因的擴增30-31
• 2.3.3 上游目的基因的擴增31
• 2.3.4 克隆全部目的基因31-33
• 2.4 討論33-35
• 第三章 新型硫酸軟骨素降解酶的異源表達及性質(zhì)研究35-52
• 3.1 實驗儀器、材料與試劑35-36
• 3.1.1 儀器35
• 3.1.2 試劑35-36
• 3.2 實驗方法36-42
• 3.2.1 目的基因的制備36
• 3.2.2 重組表達載體的構(gòu)建36-38
• 3.2.3 重組蛋白的表達38
• 3.2.4 重組蛋白的純化38-40
• 3.2.5 重組蛋白的活性驗證40
• 3.2.6 重組蛋白的性質(zhì)研究40-42
• 3.3 實驗結(jié)果42-49
• 3.3.1 重組表達載體的構(gòu)建42-44
• 3.3.2 重組蛋白的表達與純化44
• 3.3.3 重組蛋白的活性驗證44-46
• 3.3.4 重組蛋白的性質(zhì)研究46-49
• 3.4 討論49-52
• 3.4.1 基因工程菌的構(gòu)建與篩選49-50
• 3.4.2 重組蛋白的表達與純化50-51
• 3.4.3 AsChnAC底物適應(yīng)性的分析及酶學(xué)性質(zhì)研究51-52
• 第四章 催化方向的研究52-67
• 4.1 實驗儀器、材料與試劑52
• 4.1.1 儀器52
• 4.1.2 試劑52
• 4.2 實驗方法52-54
• 4.2.1 模式底物合成52-54
• 4.2.2 模式寡糖底物的降解54
• 4.3 實驗結(jié)果54-65
• 4.3.1 三糖底物合成54-56
• 4.3.2 AsChnAC降解三糖產(chǎn)物分析56-57
• 4.3.3 HP-CS-六糖合成及AsChnAC降解六糖底物分析57-60
• 4.3.4 CS-HP-六糖合成及AsChnAC降解六糖底物分析60-62
• 4.3.5 總結(jié)62-65
• 4.4 討論65-67
• 總結(jié)67-70
• 參考文獻70-75
• 致謝75-76
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文76-77
• 附錄77-82
• 附錄1 目的基因AsChnAC序列77-79
• 附錄2 AsChnAC氨基酸殘基序列79-82
• 附件82-90
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況表90

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1 徐慶陽,黎興榮,石墨,陳寧;硫酸軟骨素研究現(xiàn)狀[J];生物技術(shù)通訊;2004年06期

2 李鑫,姚開,賈冬英,賴本麗;硫酸軟骨素的提取和純化分離技術(shù)[J];天然產(chǎn)物研究與開發(fā);2004年06期

3 夏未銘;趙德懷;高睿;;硫酸軟骨素粉制備方法的改進[J];陜西師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2006年S1期

4 鄭江;關(guān)瑞章;黃世玉;;鱘魚和鯊魚硫酸軟骨素紅外光譜特性的比較研究[J];光譜學(xué)與光譜分析;2008年01期

5 吳秋林;劉立明;陳堅;;發(fā)酵法生產(chǎn)硫酸軟骨素的研究進展[J];生物工程學(xué)報;2012年11期

6 劉坤,高華,于茲東;硫酸軟骨素快速測定方法的研究[J];青島大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2003年02期

7 尹利昂;陳士國;薛長湖;董平;常耀光;徐杰;;4種海參中含巖藻糖支鏈的硫酸軟骨素化學(xué)組成差異的分析[J];中國海洋大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2009年S1期

8 夏傳俊,孟菁,楊耿;反相高效液相色譜法測定硫酸軟骨素的含量[J];安徽師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2000年04期

9 魏練平;蔣立科;;硫酸軟骨素提取工藝的研究[J];生物學(xué)雜志;2007年06期

10 陳小娥;方旭波;余輝;施金玉;吳常文;;雜交鱘(Sturgeon cartilage)軟骨中硫酸軟骨素的提取方法及分析鑒定[J];海洋與湖沼;2008年01期

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1 張?zhí)烀?凌沛學(xué);;硫酸軟骨素的過去、現(xiàn)在和將來[A];2009年中國藥學(xué)大會暨第九屆中國藥師周論文集[C];2009年

2 張?zhí)烀?凌沛學(xué);;硫酸軟骨素的過去、現(xiàn)在和將來[A];2010年中國藥學(xué)大會暨第十屆中國藥師周論文集[C];2010年

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4 高華;;硫酸軟骨素及蛋白質(zhì)的清潔化生產(chǎn)新工藝研究[A];2008年度山東省藥學(xué)會藥物化學(xué)與抗生素專業(yè)委員會年會會議論文及大會報告摘要[C];2008年

5 張青;凌沛學(xué);;硫酸軟骨素在眼科中的應(yīng)用[A];2009年中國藥學(xué)大會暨第九屆中國藥師周論文集[C];2009年

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7 徐慶陽;王振聲;陳寧;王福榮;;硫酸軟骨素提取純化新工藝[A];第一屆全國化學(xué)工程與生物化工年會論文摘要集(下)[C];2004年

8 王德利;孟凡欣;郭偉良;李明明;王貞佐;;熒光分光光度法測定硫酸軟骨素含量[A];第十五屆全國分子光譜學(xué)術(shù)報告會論文集[C];2008年

9 馬玉;李繼珩;;硫酸軟骨素的制備[A];中國海洋生化學(xué)術(shù)會議論文薈萃集[C];2005年

10 楊海霞;劉燕;劉彩霞;邢玉仁;于盛茂;;硫酸軟骨素及其鈉鹽含量測定研究近況[A];中國藥學(xué)會全國多糖類藥物研究與應(yīng)用研討會論文集[C];2008年

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1 中國醫(yī)保商會 榮嫡;硫酸軟骨素市場漸入佳境[N];中國醫(yī)藥報;2010年

2 記者 楊俊堅;硫酸軟骨素：競爭無序 行業(yè)謀變[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2011年

3 本報記者 謝玲;中國硫酸軟骨素產(chǎn)業(yè)國內(nèi)消費市場有待開啟欲走出產(chǎn)業(yè)鏈低端[N];中國食品報;2014年

4 ;利用各種動物軟骨提取硫酸軟骨素的生產(chǎn)技術(shù)[N];中國畜牧獸醫(yī)報;2007年

5 張倫;國際訂單幾乎全在中國[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2006年

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7 本報記者 陸悅;亟待走出產(chǎn)業(yè)鏈低端[N];中國醫(yī)藥報;2014年

8 王樂民;輸美肝素鈉中查出多硫酸軟骨素[N];健康報;2008年

9 魯濤 楊海軍;硫酸軟骨素行業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀[N];中國食品報;2014年

10 綜合;輸美“肝素鈉”中查出“多硫酸軟骨素”[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2008年

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1 劉春梅;硫酸軟骨素的提取與純化及性質(zhì)研究[D];吉林大學(xué);2007年

2 葉琳弘;魷魚軟骨中硫酸軟骨素的提取、純化及降血脂活性的研究[D];福建農(nóng)林大學(xué);2015年

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5 張雯;硫酸軟骨素的提取和純化方法的研究[D];江蘇大學(xué);2009年

6 周云;近紅外光譜法用于硫酸軟骨素含量測定的模型研究[D];山東大學(xué);2009年

7 謝果凰;鯊魚硫酸軟骨素的分離提純及其抗氧化功能的研究[D];寧波大學(xué);2010年

8 徐瑞聰;羊軟骨硫酸軟骨素的提取分離及抗氧化活性研究[D];北京林業(yè)大學(xué);2011年

9 李鑫;硫酸軟骨素提取和純化方法的研究[D];四川大學(xué);2005年

10 陳紅麗;硫酸軟骨素提取條件優(yōu)化研究[D];鄭州大學(xué);2006年

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