本文關鍵詞：基于幾丁質合成酶基因調控的黑曲霉發(fā)酵形態(tài)優(yōu)化

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【摘要】：檸檬酸是一種廣泛應用于食品、醫(yī)藥、化妝品和化工行業(yè)中的重要有機酸。黑曲霉(Aspergillus niger)是檸檬酸發(fā)酵工業(yè)的主要菌種,作為一種常見的絲狀真菌,在深層發(fā)酵過程中,菌絲體的形態(tài)對檸檬酸的合成代謝有重要的影響。在工業(yè)生產中,可以通過調控形態(tài)基因的表達,對菌絲體的形態(tài)進行優(yōu)化,進而提高檸檬酸的產量和產率。本文主要研究黑曲霉的幾丁質合成酶基因chsC的調控在優(yōu)化發(fā)酵形態(tài)和檸檬酸產量中的應用。本文選擇干擾載體pJL43-RNAi作為chsC基因沉默的質粒載體。首先將NcoI酶切得到的chsC基因片段與質粒pJL43-RNAi連接,構建干擾載體pchsC-RNAi.為提高干擾載體的轉化率,對原生質體制備、再生和轉化的條件進行了優(yōu)化。優(yōu)化的結果表明：在36.5℃培養(yǎng)16h的幼嫩菌絲最利于原生質體釋放；最優(yōu)的酶組合是5 mg/mL的溶菌酶,10 mg/mL的蝸牛酶和10 mg/mL的纖維素酶組成的混合酶系；在酶解溫度為30℃,以100r/min酶解3h可使原生質體的最大產量達到5.11×106/mL；最優(yōu)的再生培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)基,可以使再生率達到36.97%。然后通過聚乙二醇(PEG)的介導將干擾載體pchsC-RNAi導入黑曲霉原生質體中,篩選得到7株轉化菌。通過反轉錄PCR和實時熒光定量PCR檢測,發(fā)現(xiàn)轉化株的chsC基因發(fā)生不同程度的沉默；同時細胞壁的幾丁質含量也與chsC基因的表達量呈正相關,RNAi的效果越顯著,chsC基因的表達量越低,相應的細胞壁幾丁質含量也越低。轉化菌株的檸檬酸產量與原始菌株相比均有所提高,其中chsC-3和chsC-5的產酸量提高尤為顯著,分別提高了42.57%和36.73%。而干擾效果較明顯的chsC-7的產酸增幅反而不明顯,僅比原始菌株增長0.37%,由此推斷,chsC的表達量維持在一定水平對檸檬酸的積累有重要作用。通過顯微鏡觀察深層發(fā)酵的菌絲體形態(tài),發(fā)現(xiàn)轉化菌株的菌絲分支頻率降低,菌絲分支縮短,離散菌絲減少,與原始菌株相比,發(fā)酵液的粘度降低,進而提高了物質和氧氣在發(fā)酵液中的傳遞效率,更有利于檸檬酸的積累。通過單因素實驗法對高產菌株chsC-3在搖瓶水平的裝液量、接種量、轉速和培養(yǎng)溫度等因素進行優(yōu)化,優(yōu)化的結果是：裝液量為500 mL三角瓶裝60 mL培養(yǎng)基,接種量為5×104/mL,轉速為300 r/min,培養(yǎng)溫度為37℃。以優(yōu)化得到的最佳培養(yǎng)條件分別對CK和chsC-3菌株進行發(fā)酵培養(yǎng),檸檬酸產量較優(yōu)化前均有所提高,發(fā)酵至72 h的產酸分別提高了7.32%和21.74%。兩株菌株的發(fā)酵周期均在108 h左右,發(fā)酵結束后菌株chsC-3比菌株CK的檸檬酸產量提高5.35%。菌株CK和chsC-3的在5L種子罐和30 L發(fā)酵罐上進行深層發(fā)酵培養(yǎng),高產菌株chsC-3和原始菌株CK相比,菌球的分支頻率降低,菌絲的分支縮短,檸檬酸產量提高3.21%,糖酸轉化率提高3.20%,發(fā)酵周期縮短1 h。高產菌株chsC-3在工藝放大的過程中,表現(xiàn)出較好的生產潛力。
【關鍵詞】：黑曲霉 檸檬酸 RNA干擾 幾丁質合成酶 形態(tài)
【學位授予單位】：安徽大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：TQ920.6;Q78
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 第一章 緒論10-24
• 1.1 檸檬酸簡介10-12
• 1.1.1 檸檬酸的性質10-11
• 1.1.2 檸檬酸的作用11-12
• 1.2 黑曲霉發(fā)酵生產檸檬酸12-16
• 1.2.1 黑曲霉生物合成檸檬酸的途徑12-13
• 1.2.2 黑曲霉發(fā)酵生產檸檬酸的研究現(xiàn)狀13-16
• 1.3 絲狀真菌的形態(tài)控制16-21
• 1.3.1 概述16-17
• 1.3.2 培養(yǎng)環(huán)境17-19
• 1.3.3 形態(tài)基因19-20
• 1.3.4 RNA干擾(RNAi)在絲狀真菌中的應用20-21
• 1.4 本論文研究的背景與內容21-24
• 第二章 幾丁質合成酶基因的擴增與干擾載體的構建24-33
• 2.1 材料與方法24-29
• 2.1.1 材料24-27
• 2.1.2 方法27-29
• 2.2 結果與分析29-32
• 2.2.1 目的幾丁質合成酶基因的確定29-30
• 2.2.2 chsC基因片段的擴增30
• 2.2.3 質粒載體的提取和酶切30-31
• 2.2.4 干擾載體的構建31-32
• 2.3 小結32-33
• 第三章 原生質體的制備、再生和轉化體系的構建33-43
• 3.1 材料與方法33-37
• 3.1.1 材料33-35
• 3.1.2 方法35-37
• 3.2 結果與分析37-42
• 3.2.1 不同酶組合對原生質體形成的影響37-38
• 3.2.2 不同菌齡和酶解條件對原生質體形成的影響38-39
• 3.2.3 酶解時間對原生質體制備和再生的影響39-40
• 3.2.4 不同種類再生培養(yǎng)基對原生質體再生的影響40-41
• 3.2.5 原生質體形成過程的形態(tài)觀察41
• 3.2.6 轉化菌株的菌落形態(tài)觀察41-42
• 3.3 小結42-43
• 第四章 chsC基因沉默對深層發(fā)酵過程中菌絲體形態(tài)和檸檬酸產量的影響43-56
• 4.1 材料與方法43-50
• 4.1.1 材料43-45
• 4.1.2 方法45-50
• 4.2 結果與分析50-54
• 4.2.1 chsC基因沉默程度檢測50-51
• 4.2.2 chsC基因沉默對細胞壁幾丁質含量的影響51-53
• 4.2.3 chsC基因對菌株的檸檬酸產量的影響53
• 4.2.4 菌株深層發(fā)酵的菌絲體形態(tài)觀察53-54
• 4.3 小結54-56
• 第五章 檸檬酸高產菌株chsC-3發(fā)酵工藝優(yōu)化的初步探究56-67
• 5.1 材料與方法56-59
• 5.1.1 材料56-57
• 5.1.2 方法57-59
• 5.2 結果與分析59-66
• 5.2.1 不同裝液量對產檸檬酸的影響59
• 5.2.2 不同接種量對產檸檬酸的影響59-62
• 5.2.3 不同搖床轉速對產檸檬酸的影響62
• 5.2.4 不同培養(yǎng)溫度對產檸檬酸的影響62-63
• 5.2.5 發(fā)酵過程產酸的變化63-64
• 5.2.6 菌株的傳代穩(wěn)定性64
• 5.2.7 發(fā)酵罐培養(yǎng)對菌體形態(tài)和檸檬酸產量的影響64-66
• 5.3 小結66-67
• 第六章 總結與展望67-69
• 6.1 總結67-68
• 6.2 展望68-69
• 參考文獻69-77
• 附錄77-79
• 致謝79-80
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文目錄80

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