本文關鍵詞：轉杜仲幾丁質酶基因EuCHIT1番茄對灰霉病抗性研究

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【摘要】：番茄是全世界消費量較高,栽培最為普遍的蔬菜作物之一,由灰霉菌引起的番茄灰霉病是造成番茄減產、品質下降的一種世界性重要病害,該病害已成為限制番茄高產、高質的主要因素之一。幾丁質酶可水解大多數(shù)真菌細胞壁的主要成分幾丁質,因而具有廣譜抗真菌性,目前被廣泛應用于植物抗真菌病害基因工程育種,培育抗真菌病害作物新種質。本研究構建了35S啟動子驅動杜仲幾丁質酶基因EuCHIT1的植物表達載體pCAMBIA1301-35S-EuCHIT1,采用農桿菌介導的愈傷轉化和莖尖轉化兩種轉化方法導入Micro-Tom番茄中,通過篩選鑒定獲得轉基因植株,對其灰霉菌抗病性進行了分析。取得以下研究結果:1構建EuCHIT1植物表達載體及遺傳轉化番茄本研究以pCAMBIA1301為最初載體,采用一步克隆法構建了35S啟動子驅動杜仲幾丁質酶基因EuCHIT1表達元件、Hyg為篩選標記基因的植物表達載體pCAMBIA1301-35S-EuCHIT1。酶切及PCR驗證后將其導入根癌農桿菌LBA4404,采用愈傷遺傳轉化方法轉化番茄,篩選鑒定獲得38株轉基因植株。采用莖尖遺傳轉化方法轉化番茄,PCR鑒定獲得12株轉基因植株。2 EuCHIT1基因表達對番茄幾丁質酶活性的影響采用蝸牛酶法,對野生型和轉EuCHIT1番茄植株中幾丁質酶活性進行分析,結果表明,轉EuCHIT1番茄植株中幾丁質酶活性為2059.48 U·g-1,比野生型高62.14%。說明EuCHIT1基因在番茄中的表達可以增加番茄植株中幾丁質酶活性。3 EuCHIT1基因表達對番茄灰霉病抗性的影響采用離體葉片接種法,對野生型和轉EuCHIT1番茄接種灰霉菌,分析其發(fā)病時間和病斑大小。結果表明,野生型番茄葉片在接菌2 d后出現(xiàn)水浸狀病斑,而轉EuCHIT1番茄葉片在接菌4 d后才開始出現(xiàn)病斑。轉EuCHIT1番茄葉片不僅發(fā)病時間比野生型推遲3 d,且在接菌4 d后,轉EuCHIT1番茄葉片病斑直徑平均為6.93 mm,而野生型葉片病斑直徑平均為9.4 mm,轉EuCHIT1番茄葉片上的病斑直徑比野生型小26.28%。說明EuCHIT1在番茄中的表達提高了番茄對灰霉病的抗性。4 EuCHIT1基因表達對番茄保護性酶活性的影響分別對未接種和接種灰霉菌6 d后的野生型和轉EuCHIT1番茄SOD、POD、CAT活性和MDA含量分析表明,接菌前,轉EuCHIT1番茄植株中POD活性為2825.85 U·g-1(FW),比野生型高48.63%;MDA含量為21.84 nmol·g-1(FW),比野生型低28.25%;而SOD和CAT活性與野生型相比無顯著差異。接菌后,轉EuCHIT1番茄植株中SOD、POD和CAT活性為510.44 U·g-1(FW)、5423.92U·g-1(FW)和603.59 U·g-1(FW),分別比野生型高19.48%、116.08%和53.80%;MDA含量為26.49 nmol·g-1(FW),比野生型低37.65%。說明EuCHIT1基因在番茄中的表達增強了番茄植株的抗氧化能力,從而減少灰霉病對番茄的損傷。5 EuCHIT1基因表達對番茄病程相關蛋白基因表達的影響對野生型和轉EuCHIT1番茄接種灰霉菌,以番茄Clathrin adaptor complexes(CAC)基因作為內參,接菌6d后對接菌前、后野生型和轉EuCHIT1番茄病程相關蛋白基因PR-1a、PR-2、PR-NP24和PR-5 Real-time PCR分析表明,接菌前,轉EuCHIT1番茄中PR-1a、PR-2和PR-5基因表達量均高于野生型,分別為野生型的2.23倍、11.69倍和1.80倍,PR-NP24表達量與野生型無顯著差異;接菌后,轉EuCHIT1番茄的PR-1a、PR-2、PR-NP24和PR-5表達量也均極顯著高于野生型,分別是野生型的4.35倍、10.37倍、16.58倍和5.02倍。表明EuCHIT1基因在番茄中的表達可以提高番茄植株中病程相關蛋白基因的表達,從而增強轉基因番茄植株的抗病性。
【關鍵詞】：杜仲 幾丁質酶基因 番茄 灰霉菌 抗病性
【學位授予單位】：貴州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2;S436.412.13
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 第一章 文獻綜述10-24
• 1 番茄灰霉病研究進展10-18
• 1.1 番茄灰霉病病原菌10
• 1.2 番茄灰霉病侵染途徑10-11
• 1.3 番茄灰霉病病癥11
• 1.4 番茄灰霉病發(fā)生與危害11-12
• 1.5 番茄灰霉菌與寄主的互作機制12-14
• 1.6 番茄灰霉病防治措施14-17
• 1.7 番茄抗灰霉病育種17-18
• 2 杜仲抗真菌蛋白18-19
• 3 植物幾丁質酶基因及其在植物抗病基因工程中的應用19-22
• 3.1 幾丁質酶的酶學特性19
• 3.2 幾丁質酶的活性誘導19
• 3.3 幾丁質酶的生物功能19-21
• 3.4 幾丁質酶在植物抗真菌病害基因工程中的應用21-22
• 4 Micro-Tom番茄適于功能基因組學研究的特征及其應用22-23
• 4.1 Micro-Tom番茄適于功能基因組學研究的特征22
• 4.2 Micro-Tom番茄在基因功能鑒定中的應用22-23
• 5 本研究的目的和意義23-24
• 第二章 EuCHIT1植物表達載體構建及對Micro-Tom番茄的遺傳轉化24-44
• 1 材料24-27
• 1.1 實驗材料24
• 1.2 主要試劑及配方24-25
• 1.3 主要儀器及設備25-26
• 1.4 主要培養(yǎng)基26-27
• 2 方法27-34
• 2.1 植物表達載體的構建27-32
• 2.2 農桿菌感受態(tài)細胞的制備及DNA轉化32-34
• 3 EuCHIT1對Micro-Tom番茄的遺傳轉化34-37
• 3.1 農桿菌的培養(yǎng)及活化34-35
• 3.2 Micro-Tom番茄無菌苗的獲得35
• 3.3 農桿菌介導的Micro-Tom番茄愈傷組織遺傳轉化35-36
• 3.4 農桿菌介導的Micro-Tom番茄莖尖遺傳轉化36
• 3.5 轉基因植株的PCR鑒定36-37
• 4 結果與分析37-42
• 4.1 植物表達載體酶切鑒定37-39
• 4.2 農桿菌質粒PCR鑒定39
• 4.3 農桿菌介導的Micro-Tom番茄愈傷組織遺傳轉化及PCR鑒定39-41
• 4.4 農桿菌介導的Micro-Tom番茄莖尖遺傳轉化及PCR鑒定41-42
• 5 討論42-44
• 第三章 轉EuCHIT1番茄植株的抗病性檢測44-59
• 1 材料44-45
• 1.1 主要試劑及配方44-45
• 1.2 主要儀器及設備45
• 2 方法45-51
• 2.1 EuCHIT1基因表達對番茄幾丁質酶活性影響的測定45-46
• 2.2 灰霉菌分生孢子懸浮液的制備46
• 2.3 轉EuCHIT1番茄對灰霉病的抗性鑒定46-47
• 2.4 轉EuCHIT1番茄保護性酶活性的測定47-49
• 2.5 病程相關蛋白基因表達分析49-51
• 3 結果與分析51-56
• 3.1 EuCHIT1基因表達對番茄幾丁質酶活性的影響51-52
• 3.2 EuCHIT1基因表達對番茄灰霉病抗性的影響52-54
• 3.3 EuCHIT1基因表達對番茄保護性酶活性的影響54-55
• 3.4 EuCHIT1基因表達對番茄病程相關蛋白基因表達的影響55-56
• 4 討論56-59
• 第四章 結論、創(chuàng)新與展望59-61
• 1 結論59-60
• 2 創(chuàng)新60
• 3 展望60-61
• 參考文獻61-75
• 附錄75-76
• 致謝76-77
• 聲明77-78

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