本文關(guān)鍵詞：動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究新進(jìn)展及其在牛育種上的應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《西北農(nóng)林科技大學(xué)》 2010年

慢病毒載體介導(dǎo)線蟲(chóng)sfat-1基因轉(zhuǎn)化牛胎兒成纖維細(xì)胞優(yōu)化脂肪酸組份的研究

王嘉力  

【摘要】： 多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated Fatty Acids,PUFAs)是指化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有兩個(gè)或兩個(gè)以上不飽和烯鍵的長(zhǎng)鏈脂肪酸。近年來(lái)隨著對(duì)PUFAs生理學(xué)作用和細(xì)胞學(xué)功能研究的深入以及在醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域和營(yíng)養(yǎng)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的開(kāi)發(fā), PUFAs已經(jīng)成為脂肪酸研究領(lǐng)域中新興的熱點(diǎn)。ω-6 PUFAs和ω-3 PUFAs是PUFAs家族中最主要的成員,它們?cè)跈C(jī)體的新陳代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及免疫調(diào)節(jié)等生理活動(dòng)中起著非常重要的作用。ω-3脂肪酸脫氫酶(ω-3 Fatty Acid Desaturase)是存在于極少數(shù)動(dòng)植物體內(nèi)、以ω-6 PUFAs為底物催化生成相應(yīng)ω-3 PUFAs的一種去飽和酶,編碼這種酶的基因稱為ω-3脂肪酸脫氫酶基因(ω-3 Fatty Acid Desaturase Gene)。 本實(shí)驗(yàn)使用密碼子替換法優(yōu)化線蟲(chóng)Caenorhabditis.briggsae的ω-3脂肪酸脫氫酶基因sfat-1并用化學(xué)合成法在體外合成該基因。利用兩端含有重疊堿基序列的若干個(gè)寡核苷酸短片段和相應(yīng)引物在PCR體系中連接擴(kuò)增,再經(jīng)過(guò)酶切連接進(jìn)而合成總長(zhǎng)度為1200bp的目的片段。將化學(xué)合成的sfat-1基因和表達(dá)載體pcDNA3.1(-)進(jìn)行連接后轉(zhuǎn)染大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α,經(jīng)LB平板篩選陽(yáng)性克隆、提取質(zhì)粒和酶切鑒定后進(jìn)行測(cè)序用以驗(yàn)證目的基因的克隆。 將ω-3脂肪酸脫氫酶基因sfat-1連接于慢病毒載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞構(gòu)建攜帶目的基因的重組慢病毒pGCLV-sfat1-GFP,同時(shí)構(gòu)建空白慢病毒pGCLV-GFP為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。慢病毒載體經(jīng)過(guò)酶切、連接和包裝后進(jìn)行收集、純化濃縮、滴度測(cè)定及生物安全性檢測(cè)。 用所獲得重組慢病毒pGCLV-sfat1-GFP和慢病毒pGCLV-GFP轉(zhuǎn)化中國(guó)西門塔爾牛胎兒成纖維細(xì)胞并測(cè)定慢病毒最佳MOI,觀察并檢測(cè)牛胎兒成纖維細(xì)胞內(nèi)綠色熒光蛋白(GFP)基因的表達(dá)隨細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間變化,提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證sfat-1基因的表達(dá),使用重組慢病毒感染細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞脂肪酸進(jìn)行提取和成分分析。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:使用密碼子替換法和PCR化學(xué)合成法能夠在體外合成線蟲(chóng)Caenorhabditis.elegans的ω-3脂肪酸脫氫酶基因sfat-1;通過(guò)使用攜帶綠色熒光蛋白基因的慢病毒載體介導(dǎo)線蟲(chóng)sfat-1基因感染中國(guó)西門塔爾牛胎兒成纖維細(xì)胞能夠穩(wěn)定且高效地表達(dá)融合蛋白sfat1-GFP;由sfat-1基因編碼的ω-3脂肪酸脫氫酶在牛胎兒成纖維細(xì)胞中能夠有效地催化多種ω-6 PUFAs轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的ω-3 PUFAs,使二者比例由原來(lái)的15.32:1變?yōu)?.83:1,并且在牛胎兒成纖維細(xì)胞中產(chǎn)生更加豐富的超長(zhǎng)鏈ω-3 PUFAs。 本研究闡述了優(yōu)化牛胎兒成纖維細(xì)胞內(nèi)脂肪酸成分的有效方法,證明了優(yōu)化后的線蟲(chóng)ω-3脂肪酸脫氫酶基因sfat-1在動(dòng)物體細(xì)胞內(nèi)的作用,為在實(shí)驗(yàn)和臨床研究中制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物提供了一定的依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：S823
【目錄】：

摘要6-8

ABSTRACT8-12

第一章 文獻(xiàn)綜述12-20

1.1 多不飽和脂肪酸和脂肪酸脫氫酶12-15

1.1.1 多不飽和脂肪酸12-14

1.1.2 多不飽和脂肪酸脫氫酶基因的研究14-15

1.2 逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體15-17

1.2.1 逆轉(zhuǎn)錄病毒的分類及特征15-16

1.2.2 慢病毒載體的應(yīng)用與發(fā)展16-17

1.3 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究17-19

1.3.1 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究進(jìn)展17

1.3.2 轉(zhuǎn)基因牛的研究進(jìn)展17-18

1.3.3 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)品和食品的安全性評(píng)價(jià)及其展望18-19

1.4 本研究的目的和意義19-20

第二章 線蟲(chóng) sfat-1 的化學(xué)合成和慢病毒載體的構(gòu)建20-29

2.1 材料與方法20-24

2.1.1 菌株與質(zhì)粒20

2.1.2 主要試劑與藥品20

2.1.3 主要儀器與設(shè)備20

2.1.4 線蟲(chóng)sfat-1 的化學(xué)合成和PCR 拼接20-23

2.1.5 慢病毒載體的構(gòu)建和連接23-24

2.2 結(jié)果24-28

2.2.1 sfat-1 基因化學(xué)合成和的PCR 拼接24-25

2.2.2 合成sfat-1 基因克隆及驗(yàn)證25

2.2.3 慢病毒載體的構(gòu)建25-27

2.2.4 慢病毒顆粒的生產(chǎn)27-28

2.3 討論28-29

2.3.1 化學(xué)合成法PCR 拼接合成sfat-128

2.3.2 慢病毒的包裝與擴(kuò)增28-29

第三章 中國(guó)西門塔爾牛胎兒成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)29-34

3.1 材料與方法29-30

3.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物29

3.1.2 主要試劑、藥品和溶液的配置29

3.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備29

3.1.4 中國(guó)西門塔爾牛胎兒成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)29-30

3.2 結(jié)果30-32

3.2.1 牛胎兒成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)30-31

3.2.2 牛胎兒成纖維細(xì)胞傳代培養(yǎng)31-32

3.3 討論32-34

3.3.1 牛胎兒成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)32

3.3.2 牛胎兒成纖維細(xì)胞的傳代培養(yǎng)及純化培養(yǎng)32-33

3.3.3 牛胎兒成纖維細(xì)胞的冷凍和復(fù)蘇33-34

第四章 sfat-1 基因在牛胎兒成纖維細(xì)胞中的表達(dá)34-43

4.1 材料和方法34-36

4.1.1 主要試劑藥品34

4.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備34

4.1.3 慢病毒MOI（Multiplication Of Infection）的確定34

4.1.4 慢病毒介導(dǎo)sfat-1 基因轉(zhuǎn)化效率的檢測(cè)34-35

4.1.5 細(xì)胞總RNA 提取和 RT-PCR 的鑒定35

4.1.6 免疫印跡分析35

4.1.7 牛胎兒成纖維細(xì)胞脂肪酸的提取與GC/MS 分析35-36

4.2 結(jié)果36-40

4.2.1 慢病毒最佳MOI 測(cè)定36-37

4.2.2 綠色熒光蛋白的觀察37

4.2.3 細(xì)胞總RNA 提取和RT-PCR 鑒定37-38

4.2.4 Western Blotting 免疫印跡雜交分析38-39

4.2.5 牛胎兒成纖維細(xì)胞脂肪酸的提取及GC/MS 分析39-40

4.3 討論40-43

4.3.1 慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后GFP 表達(dá)異常41

4.3.2 慢病毒最適MOI 測(cè)定的意義41

4.3.3 脂肪酸成分分析41-43

結(jié)論43-44

參考文獻(xiàn)44-49

附錄49-56

致謝56-57

作者簡(jiǎn)介57

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10 龔國(guó)春,戴蘊(yùn)平,樊寶良,趙春江,王莉莉,王海平,鄭敏,李寧;雙標(biāo)記選擇載體轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細(xì)胞方法的建立[J];自然科學(xué)進(jìn)展;2002年12期

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 王嘉力;慢病毒載體介導(dǎo)線蟲(chóng)sfat-1基因轉(zhuǎn)化牛胎兒成纖維細(xì)胞優(yōu)化脂肪酸組份的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2010年

2 張燕;轉(zhuǎn)sfat-1基因乳腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2011年

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>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院

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