本文關(guān)鍵詞：動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究新進(jìn)展及其在牛育種上的應(yīng)用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《東北農(nóng)業(yè)大學(xué)》 2010年

牛Myf6基因克隆及在成肌細(xì)胞中的表達(dá)

湯展毅  

【摘要】： 隨著人們膳食結(jié)構(gòu)的不斷變化及對(duì)健康的日益關(guān)注,牛肉品質(zhì)受到了前所未有的重視,優(yōu)質(zhì)、高檔牛肉供不應(yīng)求。生肌家族控制著整個(gè)肌肉的發(fā)育過程,從前體肌細(xì)胞的定型、增殖以及肌纖維的形成,直到個(gè)體出生后的成熟和功能的完善,都有生肌調(diào)節(jié)因子的參與,直接影響著動(dòng)物的產(chǎn)肉能力與肌肉品質(zhì)。Myf6是生肌家族中的一員,通過深入研究myf6基因?qū)∪獍l(fā)育的調(diào)控機(jī)制,實(shí)現(xiàn)對(duì)myf6基因的調(diào)控,就能夠改變肌肉形成過程中肌纖維的性狀,從而提高牛肉品質(zhì)。 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增myf6基因片段,在質(zhì)粒pIRES2-EGFP的多克隆位點(diǎn)插入myf6基因構(gòu)建真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-myf6。脂質(zhì)體技術(shù)轉(zhuǎn)染魯西黃牛成纖維細(xì)胞和成肌細(xì)胞,通過G418篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。利用western blot、Real-time PCR技術(shù)檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后myf6基因、肌肉肌酸激酶基因和肌球蛋白輕鏈基因的表達(dá)量變化。 本實(shí)驗(yàn)初步建立了脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染myf6轉(zhuǎn)基因技術(shù),確定了G418對(duì)成纖維細(xì)胞的最小致死濃度為400μg/ml,對(duì)成肌細(xì)胞的最小致死濃度為600μg/ml,兩種細(xì)胞篩選均獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。轉(zhuǎn)染后的成纖維細(xì)胞和成肌細(xì)胞中myf6蛋白和mRNA的表達(dá)量提高(P0.01),肌肉肌酸激酶基因mRNA表達(dá)量升高(P0.01),肌球蛋白輕鏈基因的mRNA表達(dá)量也提高(P0.01)。細(xì)胞形態(tài)觀察顯示轉(zhuǎn)染后的成纖維細(xì)胞沒有形態(tài)變化,未融合為肌管。轉(zhuǎn)染后的成肌細(xì)胞融合為肌管。表明構(gòu)建的真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-myf6能在成纖維細(xì)胞和成肌細(xì)胞中高效表達(dá),并且myf6基因促進(jìn)了成肌細(xì)胞向肌肉細(xì)胞分化。 本研究旨在通過基因重組技術(shù)構(gòu)建真核表達(dá)載體,使myf6基因在魯西黃牛成纖維細(xì)胞和成肌細(xì)胞中表達(dá),建立myf6基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的技術(shù)基礎(chǔ)。獲得了myf6基因?qū)煞N細(xì)胞的分化影響的數(shù)據(jù)。本研究得到的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染myf6基因的細(xì)胞株為下一步進(jìn)行轉(zhuǎn)myf6基因肉牛體細(xì)胞克隆提供了重要的實(shí)驗(yàn)材料。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：S823;Q78
【目錄】：

摘要8-9

Abstract9-10

1 引言10-21

1.1 MRF 家族的發(fā)現(xiàn)與重要意義10

1.2 MRF 家族成員10-13

1.2.1 MyoD 基因10-11

1.2.2 Myf5 基因11-12

1.2.3 MyoG 基因12-13

1.3 Myf6 基因研究13-15

1.3.1 Myf6 基因的分子結(jié)構(gòu)13

1.3.2 Myf6 基因的功能13-14

1.3.3 myf6 基因在分化中的作用14

1.3.4 Myf6 基因的定位14-15

1.3.5 不同物種中Myf6 基因15

1.4 Myf6 基因應(yīng)用前景及展望15-17

1.4.1 在遺傳育種方面的應(yīng)用15-16

1.4.2 在肌肉的再生方面的應(yīng)用16

1.4.3 在疾病治療方面的應(yīng)用16-17

1.5 轉(zhuǎn)基因牛的研究17-19

1.5.1 動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)主要方法17-18

1.5.2 轉(zhuǎn)基因牛的研究18

1.5.3 轉(zhuǎn)基因牛的應(yīng)用18-19

1.6 研究的目的和意義19-21

2 材料與方法21-33

2.1 實(shí)驗(yàn)材料21-22

2.1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器21

2.1.2 主要實(shí)驗(yàn)材料與試劑21-22

2.2 試驗(yàn)方法22-33

2.2.1 Myf6 基因的克隆與測序22-26

2.2.2 真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-myf6 的構(gòu)建26-28

2.2.3 牛成肌細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定28

2.2.4 重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-myf6 表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染牛成纖維細(xì)胞和成肌細(xì)胞28-29

2.2.5 成纖維細(xì)胞和成肌細(xì)胞最小致死量測定29

2.2.6 重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-myf6 表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染牛成纖維細(xì)胞和成肌細(xì)胞29

2.2.7 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的顯微鏡檢測29

2.2.8 Western Blot 檢測myf6 基因蛋白表達(dá)29-30

2.2.9 Real time PCR 檢測相關(guān)基因表達(dá)30-33

3 結(jié)果與分析33-45

3.1 Myf6 基因的PCR 擴(kuò)增33

3.2 陽性重組子pMD18-M 的雙酶切鑒定33-34

3.3 Myf6 基因的序列測定34

3.4 真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-myf6 的雙酶切鑒定34-35

3.5 成肌細(xì)胞的鑒定35-36

3.6 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光檢測36-38

3.6.1 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光檢測36-37

3.6.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)觀察37-38

3.7 G418 對(duì)牛皮膚成纖維細(xì)胞最小致死量的確定38

3.8 Western Blot 檢測myf6 基因蛋白表達(dá)38-40

3.8.1 Western Blot 檢測轉(zhuǎn)染后成纖維細(xì)胞中myf6 基因的蛋白表達(dá)38-39

3.8.2 Western Blot 檢測轉(zhuǎn)染后成肌細(xì)胞中myf6 基因的蛋白表達(dá)39-40

3.9 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 檢測相關(guān)基因表達(dá)40-45

3.9.1 RT-PCR 檢測成纖維細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)40-42

3.9.2 RT-PCR 檢測轉(zhuǎn)染后成肌細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)42-45

4 討論45-50

4.1 Myf6 基因獲得和真核表達(dá)載體的構(gòu)建45-46

4.1.1 Myf6 基因獲得45

4.1.2 真核表達(dá)載體構(gòu)建45-46

4.2 Myf6 基因轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞46-47

4.2.1 轉(zhuǎn)染方法的選擇46

4.2.2 轉(zhuǎn)染條件的選擇46-47

4.2.3 Myf6 基因?qū)Τ衫w維細(xì)胞的影響47

4.3 Myf6 基因轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞47-50

4.3.1 成肌細(xì)胞的鑒定47

4.3.2 G418 篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞47-48

4.3.3 熒光定量PCR 技術(shù)48

4.3.4 Myf6 基因?qū)Τ杉〖?xì)胞的影響48-50

5 結(jié)論50-51

致謝51-52

參考文獻(xiàn)52-56

攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文56

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6 馮陽;曹建華;李新云;趙書紅;;miR-145在豬骨骼肌發(fā)育和成肌細(xì)胞分化不同時(shí)期的差異表達(dá)分析[A];中國遺傳學(xué)會(huì)模式生物與人類健康研討會(huì)會(huì)議論文集[C];2010年

7 馮陽;曹建華;李新云;趙書紅;;miR-145在豬骨骼肌發(fā)育和成肌細(xì)胞分化不同時(shí)期的差異表達(dá)分析[A];中國遺傳學(xué)會(huì)模式生物與人類健康研討會(huì)會(huì)議論文集[C];2010年

8 李惠英;周紅雨;連志云;劉立斌;羅麗;張伶君;劉舉;趙代弟;;Micro-dystrophin基因轉(zhuǎn)染C57/BL10小鼠成肌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[A];第十一屆全國神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2008年

9 阮紅峰;徐世文;;硒對(duì)雞成肌細(xì)胞硒蛋白W mRNA表達(dá)的影響[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2010年學(xué)術(shù)年會(huì)——第二屆中國獸醫(yī)臨床大會(huì)論文集(下冊(cè))[C];2010年

10 馮國清;王奎鵬;于爽;胡香杰;;巴戟天寡糖對(duì)成肌細(xì)胞增殖及分化的影響[A];第十屆全國生化與分子藥理學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編[C];2007年

中國重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 董映璧;[N];科技日?qǐng)?bào);2005年

2 劉 向;[N];中國中醫(yī)藥報(bào);2004年

3 記者 田學(xué)科;[N];科技日?qǐng)?bào);2007年

4 香港麥迪信醫(yī)學(xué)出版有限公司供稿;[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2002年

5 毛天球;[N];中國醫(yī)藥報(bào);2000年

6 張孟軍;[N];科技日?qǐng)?bào);2004年

7 葛秋芳;[N];新華每日電訊;2006年

8 記者 陳威華;[N];新華每日電訊;2002年

9 徐述湘;[N];中國醫(yī)藥報(bào);2004年

10 記者 范建;[N];科技日?qǐng)?bào);2002年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 丁可;基因修飾成肌細(xì)胞結(jié)合可注射溫敏凝膠支架構(gòu)建組織工程骨的實(shí)驗(yàn)研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2013年

2 曲江波;載脂蛋白J對(duì)誘導(dǎo)成肌細(xì)胞中CXCR4表達(dá)和遷移及潛在保護(hù)作用機(jī)制的研究[D];山東大學(xué);2010年

3 白雪;旋毛蟲排泄分泌物調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞及成肌細(xì)胞功能的體外研究[D];吉林大學(xué);2011年

4 張力;骨碎補(bǔ)總黃酮促進(jìn)轉(zhuǎn)基因成肌細(xì)胞成骨分化及引導(dǎo)性骨再生的研究[D];遼寧中醫(yī)藥大學(xué);2012年

5 唐浩;轉(zhuǎn)基因成肌細(xì)胞治療慢性心肌梗死實(shí)驗(yàn)研究—體外實(shí)驗(yàn)部分[D];中南大學(xué);2003年

6 李任;攜帶自分泌運(yùn)動(dòng)因子基因的成肌細(xì)胞自體移植促進(jìn)神經(jīng)肌肉功能恢復(fù)[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2012年

7 譚家莉;應(yīng)力條件下成肌細(xì)胞增殖、分化和凋亡的調(diào)控及其分子機(jī)制的探討[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2010年

8 鄧小玲;AFP DNA疫苗治療肝癌的實(shí)驗(yàn)研究[D];四川大學(xué);2003年

9 劉傳康;糖皮質(zhì)激素局部注射治療嬰幼兒先天性斜頸機(jī)理的研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2003年

10 孫天威;組織工程化肌及成肌細(xì)胞移植的實(shí)驗(yàn)研究[D];四川大學(xué);2005年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 孫仙蕊;線粒體通路在應(yīng)力介導(dǎo)的成肌細(xì)胞凋亡中的作用及其調(diào)控機(jī)制[D];青島大學(xué);2013年

2 吳瓊;硒對(duì)雞成肌細(xì)胞分化及骨骼肌炎癥基因表達(dá)影響的研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

3 李曉艷;光、電刺激對(duì)成肌細(xì)胞生長增殖影響的實(shí)驗(yàn)研究[D];重慶大學(xué);2013年

4 徐文進(jìn);軟骨源性形態(tài)發(fā)生蛋白2基因轉(zhuǎn)染小鼠成肌細(xì)胞表達(dá)軟骨細(xì)胞表型的實(shí)驗(yàn)研究[D];遼寧醫(yī)學(xué)院;2011年

5 程亮;成肌細(xì)胞移植治療缺血性心肌病機(jī)理的研究[D];中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué);2003年

6 翟克敏;過氧化氫調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞線粒體移動(dòng)的初步研究[D];天津體育學(xué)院;2010年

7 李松;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化及大鼠間異體移植的研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2012年

8 李菲菲;p38MAPK信號(hào)通路在應(yīng)力調(diào)控成肌細(xì)胞分化中的作用[D];山東大學(xué);2012年

9 安靜;IGF1在綿羊成肌細(xì)胞增殖與分化中的作用[D];新疆農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

10 高銘鞠;FAD24對(duì)小鼠成肌細(xì)胞增殖和分化的調(diào)節(jié)作用[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

  本文關(guān)鍵詞：動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究新進(jìn)展及其在牛育種上的應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：102515