發(fā)布時間：2017-10-11 04:43

  本文關(guān)鍵詞：rAAV2介導(dǎo)bFGF基因修飾間充質(zhì)干細胞對小鼠骨骼肌鈍挫傷修復(fù)的研究

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【摘要】：研究目的:本實驗對小鼠骨骼肌鈍挫傷造模后,應(yīng)用重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的堿性成纖維生長因子(bFGF)、間充質(zhì)干細胞(MSCs)以及基因修飾的間充質(zhì)干細胞分別對急性骨骼肌鈍挫傷小鼠進行治療,從組織學(xué)、生物化學(xué)等方面觀察骨骼肌損傷修復(fù)過程中損傷組織bFGF、膠原蛋白I、IIImRNA表達以及血清肌酸激酶的變化,比較不同治療方法的修復(fù)效果,豐富相應(yīng)研究資料。研究方法:研究對象為100只清潔級雄性ICR小鼠,其中20只小鼠不造模作為正常對照組(A組),對其余的小鼠進行骨骼肌鈍挫傷造模后隨機分為4組:自然愈合組(B組)、細胞組(C組)、基因組(D組)、轉(zhuǎn)基因細胞組(E組)。各組再分別設(shè)3天組、7天組、14天、21天組(每組5只)。參照羅麗等的方法建立骨骼肌鈍挫傷模型,給小鼠腹腔注射5%水合氯醛將其麻醉,用脫毛膏將小鼠右后腿的毛清理干凈,用自制的重物打擊器,將小鼠后肢置于打擊器底板上,使后肢處于伸膝,踝背屈90。位置,腓腸肌正對PVC管底端中心部位(管徑大于砝碼直徑),手持20g砝碼使其從81cm高的PVC管頂端順著管內(nèi)自由垂直落下打擊小鼠腓腸肌,重力為0.157N,動能為0.157J,造模后保持皮膚完整,避免感染。正常對照組不做處理,其余組分別于損傷后即刻利用微量注射器和微電極推進器,向腓腸肌斜行進針,深度約3mm,分別注射注射40ul PBS、40ul MSCs(數(shù)量約為1x105)、40ul rAAV2-bFGF、40ul轉(zhuǎn)染rAAV2-bFGF的MSCs(數(shù)量約為1x105),注射時間不少于3min,留針2min,分籠飼養(yǎng)。跟蹤測試各組不同時間點下列指標:骨骼肌組織形態(tài)學(xué)變化、損傷組織bFGF、膠原蛋白I、IIImRNA表達以及血清肌酸激酶的變化。研究結(jié)果:(1)HE染色光鏡和血漿CK活性變化提示,間充質(zhì)干細胞以及堿性成纖維生長能促進大鼠急性腓腸肌鈍挫傷后肌肉再生,減少瘢痕形成,加速損傷肌肉愈合的進程,,提高肌肉愈合質(zhì)量。(2)傷后各組bFGF表達都顯著高于A組(P0.05);隨修復(fù)時間的增加,各組bFGF呈下降趨勢,到第21天時E組bFGF表達仍顯著高于正常對照組,各組bFGF量由高到低為E組、C組、D組、B組、A組。(3)傷后各組膠原蛋白ImRNA表達呈上升趨勢,各組骨骼肌損傷后,各組I型膠原mRNA表達小幅上升,損傷后第7天,繼續(xù)上升,第14天開始,I型膠原mRNA表達迅速上升,在21天時達到峰值,E組膠原蛋白ImRNA表達量最低。與A組相比,除第3天外,各組均有非常顯著性差異(P0.01)。(4)各組膠原蛋白III mRNA表達量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,在第7天達到峰值,各組膠原蛋白III mRNA表達量由高到低依次是B組、D組、C組、E組、A組,說明間充質(zhì)細胞及堿性成纖維生長因子抑制骨骼肌鈍挫傷小鼠損傷局部組織I、III型膠原mRNA的表達。研究結(jié)論:(1)成功包裝重組腺相關(guān)病毒rAAV2-bFGF,轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細胞后可表達報告基因,目的基因bFGF也高效表達。(2)rAAV2-bFGF基因治療和間充質(zhì)干細胞治療可加快損傷肌肉愈合的組織學(xué)進程,抑制血清CK上升以及膠原蛋白Ⅰ、ⅢmRNA的表達,提高愈合質(zhì)量。(3)隨著時間的變化,各組治療效果總趨勢相同。(4)r AAV2-bFGF基因治療和間充質(zhì)干細胞治療可促進損傷肌肉的bFGF表達,促進肌肉再生,兩者聯(lián)合效果更好。
【關(guān)鍵詞】：重組2型腺相關(guān)病毒(rAAV2) 堿性成纖維生長因子(bFGF) 間充質(zhì)干細胞(MSCs) 骨骼肌頓挫傷
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R685
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstracts6-10
• 序言10-12
• 1 文獻綜述12-23
• 1.1 肌肉損傷研究進展12-16
• 1.1.1 骨骼肌損傷的種類12
• 1.1.2 骨骼肌修復(fù)的機制12-14
• 1.1.3 骨骼肌損傷研究中的動物模型14-15
• 1.1.4 骨骼肌損傷的治療15-16
• 1.2 堿性成纖維生長因子研究進展16-19
• 1.2.1.bFGF的結(jié)構(gòu)17
• 1.2.2.bFGF的作用機制17
• 1.2.3 bFGF的生物學(xué)功能17-18
• 1.2.4 bFGF與MSCs的生物學(xué)作用18-19
• 1.3 腺相關(guān)病毒（AAV）19-20
• 1.3.1 腺相關(guān)病毒結(jié)構(gòu)19-20
• 1.3.2 AAV作為基因載體的優(yōu)缺點20
• 1.3.3 AAV在肌肉損傷方面的應(yīng)用20
• 1.4 間充質(zhì)干細胞（MSCs）研究進展20-23
• 1.4.1 間充質(zhì)干細胞的來源及其優(yōu)缺點21
• 1.4.2 間充質(zhì)干細胞在組織修復(fù)方面的作用21-22
• 1.4.3 間充質(zhì)干細胞的遷移及歸巢能力22-23
• 2 材料和方法23-38
• 2.1 實驗動物與分組23
• 2.2 小鼠肌肉損傷模型的制備23
• 2.3 rAAV2-bFGF的包裝及鑒定23-33
• 2.3.1 pAAV-iRFP713-IRES-bFGF質(zhì)粒的構(gòu)建24-29
• 2.3.2 病毒包裝、純化及鑒定29-33
• 2.4 病毒感染MSCs33
• 2.5 注射33
• 2.6 取材33
• 2.7 檢測指標與測試方法33-36
• 2.7.1 光鏡觀察腓腸肌HE染色33-34
• 2.7.2 bFGF表達的檢測34-35
• 2.7.3 血漿CK活性測定35
• 2.7.4 腓腸肌膠原蛋白Ⅰ、ⅢmRNA表達量的測定35-36
• 2.8 實驗所需主要儀器及試劑36
• 2.9 數(shù)據(jù)處理36-38
• 3 結(jié)果38-51
• 3.1 rAAV2--bFGF病毒包裝結(jié)果及其在細胞內(nèi)報告基因表達38-42
• 3.1.1 重組質(zhì)粒pAAV-iRFP713-IRES-bFGF的鑒定38
• 3.1.2 rAAV2-bFGF病毒滴度測定結(jié)果38-39
• 3.1.3 病毒純化結(jié)果的鑒定39-40
• 3.1.4 病毒感染MSCs的鑒定40-42
• 3.2 各組小鼠肌肉組織HE染色光鏡觀察結(jié)果比較42-46
• 3.3 各組小鼠肌肉bFGF蛋白表達的免疫組化結(jié)果46-47
• 3.4 各組小鼠血清肌酸激酶活性比較47-49
• 3.5 各組小鼠腓腸肌膠原蛋白III mRNA表達結(jié)果比較49-50
• 3.6 各組小鼠腓腸肌膠原蛋白I mRNA表達結(jié)果比較50-51
• 4 討論51-56
• 4.1 不同治療方法對骨骼肌急性鈍挫傷小鼠組織形態(tài)學(xué)的影響51-52
• 4.2 不同治療方法對骨骼肌急性鈍挫傷小鼠bFGF蛋白表達量的影響52-53
• 4.3 不同治療方法對骨骼肌急性鈍挫傷小鼠血清肌酸激酶的影響53-54
• 4.4 不同治療方法對骨骼肌急性鈍挫傷小鼠膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ mRNA的影響54-56
• 5 結(jié)論56-57
• 6 參考文獻57-65
• 7 攻讀碩士學(xué)位期間公開發(fā)表論文65-66
• 8 致謝66-67

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本文編號：1010581