本文關(guān)鍵詞：rAAV2介導(dǎo)bFGF基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)小鼠骨骼肌鈍挫傷修復(fù)的研究

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【摘要】：研究目的:本實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠骨骼肌鈍挫傷造模后,應(yīng)用重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)、間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)以及基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞分別對(duì)急性骨骼肌鈍挫傷小鼠進(jìn)行治療,從組織學(xué)、生物化學(xué)等方面觀察骨骼肌損傷修復(fù)過程中損傷組織bFGF、膠原蛋白I、IIImRNA表達(dá)以及血清肌酸激酶的變化,比較不同治療方法的修復(fù)效果,豐富相應(yīng)研究資料。研究方法:研究對(duì)象為100只清潔級(jí)雄性ICR小鼠,其中20只小鼠不造模作為正常對(duì)照組(A組),對(duì)其余的小鼠進(jìn)行骨骼肌鈍挫傷造模后隨機(jī)分為4組:自然愈合組(B組)、細(xì)胞組(C組)、基因組(D組)、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞組(E組)。各組再分別設(shè)3天組、7天組、14天、21天組(每組5只)。參照羅麗等的方法建立骨骼肌鈍挫傷模型,給小鼠腹腔注射5%水合氯醛將其麻醉,用脫毛膏將小鼠右后腿的毛清理干凈,用自制的重物打擊器,將小鼠后肢置于打擊器底板上,使后肢處于伸膝,踝背屈90。位置,腓腸肌正對(duì)PVC管底端中心部位(管徑大于砝碼直徑),手持20g砝碼使其從81cm高的PVC管頂端順著管內(nèi)自由垂直落下打擊小鼠腓腸肌,重力為0.157N,動(dòng)能為0.157J,造模后保持皮膚完整,避免感染。正常對(duì)照組不做處理,其余組分別于損傷后即刻利用微量注射器和微電極推進(jìn)器,向腓腸肌斜行進(jìn)針,深度約3mm,分別注射注射40ul PBS、40ul MSCs(數(shù)量約為1x105)、40ul rAAV2-bFGF、40ul轉(zhuǎn)染rAAV2-bFGF的MSCs(數(shù)量約為1x105),注射時(shí)間不少于3min,留針2min,分籠飼養(yǎng)。跟蹤測(cè)試各組不同時(shí)間點(diǎn)下列指標(biāo):骨骼肌組織形態(tài)學(xué)變化、損傷組織bFGF、膠原蛋白I、IIImRNA表達(dá)以及血清肌酸激酶的變化。研究結(jié)果:(1)HE染色光鏡和血漿CK活性變化提示,間充質(zhì)干細(xì)胞以及堿性成纖維生長(zhǎng)能促進(jìn)大鼠急性腓腸肌鈍挫傷后肌肉再生,減少瘢痕形成,加速損傷肌肉愈合的進(jìn)程,,提高肌肉愈合質(zhì)量。(2)傷后各組bFGF表達(dá)都顯著高于A組(P0.05);隨修復(fù)時(shí)間的增加,各組bFGF呈下降趨勢(shì),到第21天時(shí)E組bFGF表達(dá)仍顯著高于正常對(duì)照組,各組bFGF量由高到低為E組、C組、D組、B組、A組。(3)傷后各組膠原蛋白ImRNA表達(dá)呈上升趨勢(shì),各組骨骼肌損傷后,各組I型膠原mRNA表達(dá)小幅上升,損傷后第7天,繼續(xù)上升,第14天開始,I型膠原mRNA表達(dá)迅速上升,在21天時(shí)達(dá)到峰值,E組膠原蛋白ImRNA表達(dá)量最低。與A組相比,除第3天外,各組均有非常顯著性差異(P0.01)。(4)各組膠原蛋白III mRNA表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),在第7天達(dá)到峰值,各組膠原蛋白III mRNA表達(dá)量由高到低依次是B組、D組、C組、E組、A組,說明間充質(zhì)細(xì)胞及堿性成纖維生長(zhǎng)因子抑制骨骼肌鈍挫傷小鼠損傷局部組織I、III型膠原mRNA的表達(dá)。研究結(jié)論:(1)成功包裝重組腺相關(guān)病毒rAAV2-bFGF,轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞后可表達(dá)報(bào)告基因,目的基因bFGF也高效表達(dá)。(2)rAAV2-bFGF基因治療和間充質(zhì)干細(xì)胞治療可加快損傷肌肉愈合的組織學(xué)進(jìn)程,抑制血清CK上升以及膠原蛋白Ⅰ、ⅢmRNA的表達(dá),提高愈合質(zhì)量。(3)隨著時(shí)間的變化,各組治療效果總趨勢(shì)相同。(4)r AAV2-bFGF基因治療和間充質(zhì)干細(xì)胞治療可促進(jìn)損傷肌肉的bFGF表達(dá),促進(jìn)肌肉再生,兩者聯(lián)合效果更好。
【關(guān)鍵詞】：重組2型腺相關(guān)病毒(rAAV2) 堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF) 間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs) 骨骼肌頓挫傷
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R685
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstracts6-10
• 序言10-12
• 1 文獻(xiàn)綜述12-23
• 1.1 肌肉損傷研究進(jìn)展12-16
• 1.1.1 骨骼肌損傷的種類12
• 1.1.2 骨骼肌修復(fù)的機(jī)制12-14
• 1.1.3 骨骼肌損傷研究中的動(dòng)物模型14-15
• 1.1.4 骨骼肌損傷的治療15-16
• 1.2 堿性成纖維生長(zhǎng)因子研究進(jìn)展16-19
• 1.2.1.bFGF的結(jié)構(gòu)17
• 1.2.2.bFGF的作用機(jī)制17
• 1.2.3 bFGF的生物學(xué)功能17-18
• 1.2.4 bFGF與MSCs的生物學(xué)作用18-19
• 1.3 腺相關(guān)病毒（AAV）19-20
• 1.3.1 腺相關(guān)病毒結(jié)構(gòu)19-20
• 1.3.2 AAV作為基因載體的優(yōu)缺點(diǎn)20
• 1.3.3 AAV在肌肉損傷方面的應(yīng)用20
• 1.4 間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）研究進(jìn)展20-23
• 1.4.1 間充質(zhì)干細(xì)胞的來源及其優(yōu)缺點(diǎn)21
• 1.4.2 間充質(zhì)干細(xì)胞在組織修復(fù)方面的作用21-22
• 1.4.3 間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移及歸巢能力22-23
• 2 材料和方法23-38
• 2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組23
• 2.2 小鼠肌肉損傷模型的制備23
• 2.3 rAAV2-bFGF的包裝及鑒定23-33
• 2.3.1 pAAV-iRFP713-IRES-bFGF質(zhì)粒的構(gòu)建24-29
• 2.3.2 病毒包裝、純化及鑒定29-33
• 2.4 病毒感染MSCs33
• 2.5 注射33
• 2.6 取材33
• 2.7 檢測(cè)指標(biāo)與測(cè)試方法33-36
• 2.7.1 光鏡觀察腓腸肌HE染色33-34
• 2.7.2 bFGF表達(dá)的檢測(cè)34-35
• 2.7.3 血漿CK活性測(cè)定35
• 2.7.4 腓腸肌膠原蛋白Ⅰ、ⅢmRNA表達(dá)量的測(cè)定35-36
• 2.8 實(shí)驗(yàn)所需主要儀器及試劑36
• 2.9 數(shù)據(jù)處理36-38
• 3 結(jié)果38-51
• 3.1 rAAV2--bFGF病毒包裝結(jié)果及其在細(xì)胞內(nèi)報(bào)告基因表達(dá)38-42
• 3.1.1 重組質(zhì)粒pAAV-iRFP713-IRES-bFGF的鑒定38
• 3.1.2 rAAV2-bFGF病毒滴度測(cè)定結(jié)果38-39
• 3.1.3 病毒純化結(jié)果的鑒定39-40
• 3.1.4 病毒感染MSCs的鑒定40-42
• 3.2 各組小鼠肌肉組織HE染色光鏡觀察結(jié)果比較42-46
• 3.3 各組小鼠肌肉bFGF蛋白表達(dá)的免疫組化結(jié)果46-47
• 3.4 各組小鼠血清肌酸激酶活性比較47-49
• 3.5 各組小鼠腓腸肌膠原蛋白III mRNA表達(dá)結(jié)果比較49-50
• 3.6 各組小鼠腓腸肌膠原蛋白I mRNA表達(dá)結(jié)果比較50-51
• 4 討論51-56
• 4.1 不同治療方法對(duì)骨骼肌急性鈍挫傷小鼠組織形態(tài)學(xué)的影響51-52
• 4.2 不同治療方法對(duì)骨骼肌急性鈍挫傷小鼠bFGF蛋白表達(dá)量的影響52-53
• 4.3 不同治療方法對(duì)骨骼肌急性鈍挫傷小鼠血清肌酸激酶的影響53-54
• 4.4 不同治療方法對(duì)骨骼肌急性鈍挫傷小鼠膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ mRNA的影響54-56
• 5 結(jié)論56-57
• 6 參考文獻(xiàn)57-65
• 7 攻讀碩士學(xué)位期間公開發(fā)表論文65-66
• 8 致謝66-67

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本文編號(hào)：1010581