本文關(guān)鍵詞：Ⅱ類啟動子調(diào)控CRISPR系統(tǒng)中sgRNA的表達(dá)實現(xiàn)特異性的基因突變

  更多相關(guān)文章： CRISPR/Cas9系統(tǒng) 單鏈引導(dǎo)RNA RNA聚合酶Ⅱ類啟

【摘要】：CRISPR/Cas9系統(tǒng),作為新興的強有力的基因編輯以及遺傳篩選工具,通過體外基因編輯,在疾病模型的建立以及基因治療等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域方面具有廣泛的的應(yīng)用前景。然而,CRISPR/Cas9系統(tǒng)在實際應(yīng)用過程中仍然面臨著一些技術(shù)難題,問題之一就在于很難進(jìn)行精準(zhǔn)可控的基因編輯。CRISPR/Cas9系統(tǒng)在行使基因編輯功能的過程中主要包括兩個成員,Cas9蛋白和單鏈的引導(dǎo)RNA(sigle-guide RNA,sgRNA)。其中Cas9蛋白是由RNA聚合酶Ⅱ(pol Ⅱ)類啟動子調(diào)控表達(dá)的一種核酸酶,可以進(jìn)行組織細(xì)胞的特異性表達(dá)調(diào)控。sgRNA用于識別靶位點,其轉(zhuǎn)錄是受到RNA聚合酶Ⅲ(pol Ⅲ)類啟動子調(diào)控的。而Ⅲ類啟動子調(diào)控表達(dá)的一大缺陷就在于難以控制,受其調(diào)控的基因一般會呈現(xiàn)出類似于看家基因的“無處不在”表達(dá)的特點,因此使sgRNA也能以一種組織特異性表達(dá)調(diào)控的方式進(jìn)行表達(dá)更有利于組織特異性基因突變的產(chǎn)生。本文中,我們對經(jīng)典的CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行巧妙的修改,使sgRNA也能在RNA聚合酶Ⅱ類啟動子的調(diào)控下進(jìn)行表達(dá),并進(jìn)一步通過使用細(xì)胞特異性啟動子來調(diào)控sgRNA的表達(dá)從而實現(xiàn)了細(xì)胞特異性的基因突變。為了能獲得RNA聚合酶Ⅱ類啟動子調(diào)控的sgRNA,我們構(gòu)建獲得microRNA-shRNA與sgRNA鑲嵌(mi Rsh-sgRNA)盒。該結(jié)構(gòu)中的sgRNA是受RNA聚合酶Ⅱ類啟動子調(diào)控的,并能夠從紅色熒光蛋白的3,非翻譯區(qū)(untranslational region,UTR)轉(zhuǎn)錄出來,為了檢測功能性的sgRNA能否在此結(jié)構(gòu)中順利產(chǎn)生,我們將廣譜性啟動子EF1a調(diào)控的miRsh-sgp53表達(dá)載體以及Cas9-P2A-EGFP表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)和小鼠胚胎干細(xì)胞(mouse embryonic stem cells,mESCs)。轉(zhuǎn)然后兩基因一般會呈現(xiàn)出類似于看家基因的“無處不在”表達(dá)的特點,因此使sgRNA也能以一種組織天采用流式細(xì)胞分選(flurorescence-activated cell sorting,FACS)的方式分選出雙熒光蛋白表達(dá)的細(xì)胞,并對分選出的細(xì)胞進(jìn)一步進(jìn)行T7EN1酶切及sanger測序,結(jié)果表明無論是MEFs還是mESCs,EF1a啟動子調(diào)控mi Rsh-sgp53產(chǎn)生的sg RNA都能夠引導(dǎo)Cas9蛋白對p53基因進(jìn)行雙鏈切割(double strand breaks,DSB)。為了進(jìn)一步證實是否mi Rsh-sg RNA盒能夠以細(xì)胞類型特異性的方式產(chǎn)生基因突變,我們構(gòu)建獲得小鼠胚胎類啟動子調(diào)控的。而Ⅲ類啟動子調(diào)控表達(dá)的一大缺陷就在于難以控制,受其調(diào)控的基因一般會呈現(xiàn)出類干細(xì)胞特異性的Oct4啟動子(mouse Oct4 gene promoter,mOct4P)來調(diào)控sgRNA表達(dá)的mi Rsh-sgp53盒,將該載體以及EF1a啟動子調(diào)控表達(dá)的Cas9-P2A-EGFP表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染MEFs和mESCs兩天后,在mESCs中,我們能夠觀察到紅色熒光蛋白、綠色熒光蛋白共同表達(dá)的細(xì)胞,但在MEFs中,僅有綠色熒光蛋白的表達(dá),這一現(xiàn)象表明sgRNA以細(xì)胞類型特異性的方式產(chǎn)生。通過流式細(xì)胞分選的方式分選出這兩類細(xì)胞進(jìn)一步進(jìn)行T7EN1酶切及sanger測序分析。我們發(fā)現(xiàn)p53基因的突變僅發(fā)生在小鼠胚胎干細(xì)胞中,而沒有發(fā)生在小鼠成纖維細(xì)胞中。此外,T7EN1酶切及sanger測序表明我們構(gòu)建的這種由RNA聚合酶Ⅱ類啟動子調(diào)控CRISPR/Cas9系統(tǒng)較經(jīng)典的CRISPR/Cas9系統(tǒng)在所有被檢測的細(xì)胞中,均沒有帶來額外的脫靶效應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】：CRISPR/Cas9系統(tǒng) 單鏈引導(dǎo)RNA RNA聚合酶Ⅱ類啟
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q78
【目錄】：

• 摘要8-10
• 英文摘要10-12
• 1 前言12-24
• 1.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)12-18
• 1.1.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)12
• 1.1.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)12-13
• 1.1.3 CRISPR/Cas系統(tǒng)的作用機理13-15
• 1.1.4 CRISPR/Cas系統(tǒng)的分類15
• 1.1.5 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)研究進(jìn)展15-16
• 1.1.6 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的應(yīng)用16-18
• 1.1.7 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的誘導(dǎo)性調(diào)控18
• 1.2 miRNA-shRNA嵌套結(jié)構(gòu)18-21
• 1.2.1 RNA干擾技術(shù)18-20
• 1.2.2 miRNA-shRNA嵌套結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)20-21
• 1.3 P53基因概述21-22
• 1.4 本研究的目的及意義22-24
• 2 材料與方法24-45
• 2.1 實驗材料24-30
• 2.1.1 質(zhì)粒24
• 2.1.2 工具酶、試劑盒及其它試劑24-26
• 2.1.3 引物序列26-27
• 2.1.4 主要器材27-28
• 2.1.5 緩沖液及主要試劑的配制28-30
• 2.1.6 主要生物學(xué)分析軟件30
• 2.2 實驗方法30-45
• 2.2.1 載體骨架的構(gòu)建30-35
• 2.2.2 miRsh-sgp53的構(gòu)建35-37
• 2.2.3 RNA聚合酶Ⅱ類啟動子調(diào)控的miRsh-sgp53載體的構(gòu)建37-41
• 2.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染41-43
• 2.2.5 流式細(xì)胞儀分選陽性細(xì)胞43
• 2.2.6 T7EN1酶切實驗43-44
• 2.2.7 sanger測序44-45
• 3 結(jié)果與分析45-51
• 3.1 RNA聚合聚合酶Ⅱ類啟動子調(diào)控的miRsh-sgp53載體的構(gòu)建45-47
• 3.2 EF1a調(diào)控miRsh-sgp53盒內(nèi)的sgRNA的表達(dá)情況47
• 3.3 干細(xì)胞特異性啟動子調(diào)控miRsh-sgRNA盒內(nèi)的sgRNA的表達(dá)情況47-48
• 3.4 miRsh-sgRNA盒差生脫靶效應(yīng)情況48-51
• 4 討論51-52
• 5 結(jié)論52-53
• 致謝53-54
• 參考文獻(xiàn)54-59
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文59

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本文編號：1009996