本文關(guān)鍵詞：β-葡萄糖苷酶基因的篩選及性質(zhì)分析

  更多相關(guān)文章： 宏基因組 秸稈 β-葡萄糖苷酶 酶學(xué)性質(zhì) 真核表達(dá)

【摘要】：β-葡萄糖苷酶(β-D-Glucosidase,EC3.2.1.21),屬于纖維素酶類,是三種纖維素分解酶中的重要組成成分之一,它能夠水解結(jié)合于末端非還原性的β-D-葡萄糖鍵,同時釋放出β-D-葡萄糖和相應(yīng)的配基。β-葡萄糖苷酶有較廣泛的工業(yè)應(yīng)用,可用來降解纖維素生產(chǎn)生物乙醇、改善食品風(fēng)味、轉(zhuǎn)化大豆異黃酮糖苷化合物、制備低聚龍膽糖、防治病蟲害等。但目前工業(yè)用β-葡萄糖苷酶多數(shù)來源于木霉等真菌,反應(yīng)條件(如溫度、pH)適應(yīng)范圍相對較窄,且酶活力偏低,造成經(jīng)濟成本較高,制約β-葡萄糖苷酶的廣泛應(yīng)用。為獲得酶學(xué)特性優(yōu)良且酶活力高的β-葡萄糖苷酶,本研究用黑龍江玉米秸稈土壤微生物群落成功構(gòu)建了一個高質(zhì)量的宏基因組文庫,并利用功能篩選法從文庫中篩選到一個新型β-葡萄糖苷酶基因bgl2238,該基因全長2238 bp,可編碼745個氨基酸,通過氨基酸序列分析,預(yù)測Bgl2238蛋白分子大小為80.67 kDa,pI值為4.95,是一種結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定、疏水性高且無信號肽序列的酸性蛋白質(zhì);經(jīng)同源性分析,發(fā)現(xiàn)其與來源于Bacteroides thetaiotaomicron的β-葡萄糖苷酶(GenBank:WP_048691945.1)具有58%的相似性,屬于GH3超家族和GH3C超家族酶。通過PCR技術(shù)擴增bgl2238基因,并成功構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-32a(+)-bgl2238,以E.coli BL21(DE3)為宿主菌株,對其進行高效表達(dá)。重組Bgl2238菌株表達(dá)條件的優(yōu)化結(jié)果顯示,Bgl2238最佳誘導(dǎo)溫度和時間分別為25℃、11 h,IPTG最適誘導(dǎo)濃度為1.0 mM,此時表達(dá)量為10.42 U/ml。對重組酶Bgl2238的酶學(xué)性質(zhì)進行研究,發(fā)現(xiàn)重組Bgl2238最適反應(yīng)pH和溫度分別為6.10,44℃,該酶最大比活達(dá)到29.1 U/mg,且在4~50℃范圍內(nèi),熱處理重組Bgl2238 4 h后仍保留75%以上的酶活力,熱穩(wěn)定性較好。以4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)為底物時其Vmax=576uM/min,Km=0.296 mM,以纖維二糖為底物時,其Vmax=572 uM/min,Km=0.543 mM。不同濃度的K+、Na+、Fe~(2+)、Mg~(2+)、Mn~(2+)、Cu~(2+)、Ca~(2+)、Co~(2+)、Zn~(2+)和Ni~(2+)對酶活力均有較大促進作用,其中Fe~(2+)對Bgl2238酶活力的促進作用最大,10 mM Fe~(2+)使酶活力高達(dá)260%;低濃度1 mM的SDS、EDTA和咪唑?qū)Ζ?葡萄糖苷酶Bgl2238酶活力有較弱的抑制作用,在100 mM時,SDS、EDTA和咪唑?qū)γ傅囊种谱饔眉訌?尿素、鹽酸胍和異硫氰酸胍在1 mM時對β-葡萄糖苷酶Bgl2238的酶活力均有促進作用,在高濃度時,Bgl2238酶活力仍分別保留97%、52%、48%。有機溶劑DMSO、甲醇、乙醇、異丙醇、Triton X-100在1 mM時對β-葡萄糖苷酶Bgl2238的酶活力均有促進作用,在高濃度時,對酶均有一定的抑制作用,但令人感興趣的是,DMSO濃度高達(dá)100 mM時,Bgl2238的酶活力仍保留85%以上,此外Triton X-100濃度的升高反而促進重組Bgl2238的酶活力,說明重組Bgl2238對有機溶劑有較好的耐受性,在工業(yè)應(yīng)用中具有很好的應(yīng)用前景。葡萄糖作為β-葡萄糖苷酶酶促反應(yīng)的產(chǎn)物,對酶促反應(yīng)有一定的反饋抑制作用,但當(dāng)葡萄糖濃度為1.0 M時,Bgl2238剩余酶活為56%左右,表明Bgl2238對葡萄糖有一定的耐受性。將bgl2238基因克隆到酵母表達(dá)載體上,并轉(zhuǎn)入釀酒酵母菌株INVSC1中,得到可溶性高表達(dá)的重組蛋白,表達(dá)量達(dá)17.1 U/ml,比活力為38.7 U/mg。本論文成功構(gòu)建高質(zhì)量的黑龍江玉米秸稈土壤宏基因組文庫,獲得了一個新型的β-葡萄糖苷酶基因,將其在原核系統(tǒng)中表達(dá)后,對重組酶的酶學(xué)性質(zhì)進行了研究,并探索了該基因在真核表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)情況。本論文的研究結(jié)果不但拓寬了b-葡萄糖苷酶的種類和研究領(lǐng)域,對于豐富纖維素酶的來源、加強未培養(yǎng)微生物中纖維素酶的應(yīng)用研究都具有一定的價值。
【關(guān)鍵詞】：宏基因組 秸稈 β-葡萄糖苷酶 酶學(xué)性質(zhì) 真核表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q55
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-13
• 第一章 前言13-24
• 1.1 纖維素酶研究概況13-16
• 1.1.1 纖維素的簡介13-14
• 1.1.2 纖維素酶的簡介14-16
• 1.2 β-葡萄糖苷酶簡介16-19
• 1.2.1 β-葡萄糖苷酶的定義和分類16-17
• 1.2.2 β-葡萄糖苷酶的結(jié)構(gòu)17
• 1.2.3 β-葡萄糖苷酶的理化性質(zhì)17-18
• 1.2.4 β-葡萄糖苷酶的應(yīng)用18-19
• 1.3 宏基因?qū)W簡介19-21
• 1.3.1 宏基因組學(xué)概念19-20
• 1.3.2 宏基因組學(xué)的研究策略20
• 1.3.3 宏基因組技術(shù)的應(yīng)用20-21
• 1.4 秸稈還田土壤的簡介21-22
• 1.5 本研究的目的和意義22-23
• 1.6 本論文的主要研究內(nèi)容23-24
• 第二章 玉米秸稈還田土壤宏基因組文庫構(gòu)建及新型β-葡萄糖苷酶基因的篩選24-42
• 引言24-25
• 2.1 實驗材料25-28
• 2.1.1 實驗樣品來源25
• 2.1.2 菌種和質(zhì)粒25
• 2.1.3 主要儀器和設(shè)備25-26
• 2.1.4 培養(yǎng)基26
• 2.1.5 工具酶、試劑盒和其他試劑26-27
• 2.1.6 相關(guān)溶液的配制27-28
• 2.2 實驗方法28-33
• 2.2.1 玉米秸稈還田土壤基因組總DNA的提取及純化28-29
• 2.2.2 玉米秸稈還田土壤宏基因組文庫的構(gòu)建29-32
• 2.2.3 宏基因組文庫的評估32
• 2.2.4 土壤宏基因組文庫β-葡萄糖苷酶的篩選32
• 2.2.5 測序及序列的生物信息學(xué)分析32-33
• 2.3 實驗結(jié)果與分析33-41
• 2.3.1 玉米秸稈還田土壤總DNA的提取及純化33
• 2.3.2 土壤總DNA的不完全酶切33-35
• 2.3.3 土壤宏基因組文庫的評估35-36
• 2.3.4 土壤宏基因組文庫中β-葡萄糖苷酶的篩選36
• 2.3.5 β-葡萄糖苷酶陽性克隆子的酶切驗證36-37
• 2.3.6 測序及生物信息學(xué)分析37-39
• 2.3.7 Bgl2238的氨基酸序列、二級結(jié)構(gòu)分析39-41
• 2.4 本章小結(jié)與討論41-42
• 第三章 β-葡萄糖苷酶基因的原核表達(dá)、表達(dá)條件優(yōu)化及其酶學(xué)性質(zhì)研究42-72
• 引言42
• 3.1 實驗材料42-46
• 3.1.1 各種試劑的配制42-45
• 3.1.2 菌種與質(zhì)粒45
• 3.1.3 主要試劑45
• 3.1.4 培養(yǎng)基45
• 3.1.5 主要儀器設(shè)備45-46
• 3.2 實驗方法46-55
• 3.2.1 β-葡萄糖苷酶基因bgl2238的引物設(shè)計及合成46
• 3.2.2 β-葡萄糖苷酶基因bgl2238的克隆46-47
• 3.2.3 PCR產(chǎn)物的純化47
• 3.2.4 PCR產(chǎn)物和載體的雙酶切、回收47
• 3.2.5 bgl2238與載體連接47-48
• 3.2.6 E .coli BL21(DE3)鈣轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化48
• 3.2.7 重組克隆子的篩選及鑒定48-49
• 3.2.8 重組表達(dá)菌株表達(dá)條件的優(yōu)化及純化49-50
• 3.2.9 目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)50
• 3.2.10 重組β-葡萄糖苷酶Bgl2238的純化50-51
• 3.2.11 重組β-葡萄糖苷酶Bgl2238的SDS-PAGE凝膠檢測51-52
• 3.2.12 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作52-53
• 3.2.13 重組β-葡萄糖苷酶Bgl2238的酶學(xué)性質(zhì)研究53-55
• 3.3 實驗結(jié)果和分析55-69
• 3.3.1 β-葡萄糖苷酶基因bgl2238的克隆55-56
• 3.3.2 重組表達(dá)載體的驗證56-57
• 3.3.3 重組β-葡萄糖苷酶表達(dá)條件的優(yōu)化57-60
• 3.3.4 重組蛋白Bgl2238的分離純化60-61
• 3.3.5 β-葡萄糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)分析61-69
• 3.4 本章小結(jié)與討論69-72
• 第四章 β-葡萄糖苷酶釀酒酵母真核表達(dá)72-82
• 引言72-73
• 4.1 實驗材料73-75
• 4.1.1 菌株與質(zhì)粒載體73
• 4.1.2 酶和生化試劑73
• 4.1.3 試劑盒73
• 4.1.4 培養(yǎng)基73-75
• 4.1.5 實驗儀器75
• 4.2 實驗方法75-77
• 4.2.1 β-葡萄糖苷酶基因的引物設(shè)計與合成75
• 4.2.2 基因的PCR擴增、酶切、載體連接和化轉(zhuǎn)大腸桿菌DH5a75
• 4.2.3 重組子的篩選及鑒定75
• 4.2.4 釀酒酵母INVSC1電轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化方法75-76
• 4.2.5 酵母重組子的鑒定76
• 4.2.6 重組蛋白Bgl2238的表達(dá)和純化76-77
• 4.2.7 重組蛋白Bgl2238的SDS-PAGE凝膠檢測77
• 4.3 實驗結(jié)果和分析77-80
• 4.3.1 β-葡萄糖苷酶基因的鑒定77-78
• 4.3.2 酵母重組子pYES2-bgl2238的鑒定78-80
• 4.3.3 重組Bgl2238的誘導(dǎo)表達(dá)和分離純化80
• 4.4 本章小結(jié)與討論80-82
• 第五章 總結(jié)與展望82-84
• 5.1 結(jié)論82-83
• 5.2 展望83-84
• 參考文獻(xiàn)84-91
• 縮略詞91-92
• 附錄 碩士研究生期間發(fā)表論文92-93
• 致謝93

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