發(fā)布時間：2017-09-27 15:29

  本文關(guān)鍵詞：新型的無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析新方法研究

  更多相關(guān)文章： 無標(biāo)記 模擬酶 流動注射 化學(xué)發(fā)光 傳感陣列 免疫分析

【摘要】：無標(biāo)記免疫分析技術(shù)能夠直接測定生物樣品,測定過程中無需預(yù)先對抗體或抗原進(jìn)行標(biāo)記,具有檢測成本低,樣品消耗少,耗費時間短,操作簡單等顯著優(yōu)勢,適應(yīng)直接、實時、原位、在線的痕量免疫分析。而化學(xué)發(fā)光免疫分析,同時發(fā)揮了免疫分析的高特異性和化學(xué)發(fā)光檢測高靈敏的優(yōu)勢,逐漸發(fā)展成熟且在免疫分析領(lǐng)域已成為研究熱點之一。模擬酶制備簡單,性質(zhì)穩(wěn)定,不易受外界環(huán)境的影響,易修飾和改性,應(yīng)用方便靈活,且具有較高的催化活性和專一的底物選擇性。此外,基于免疫傳感陣列而建立起來的空間分辨多組分免疫分析方法可實現(xiàn)更高的檢測通量和多樣品的同時檢測。本論文首次提出了新型的無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光策略,并圍繞該分析策略,通過從天然酶到納米模擬酶以及從單組分免疫分析到多組分免疫分析的過渡,實現(xiàn)了快速、靈敏、低成本的檢測生物分子,具體開展了以下幾個方面的研究工作：(1)本文首次提出了一種廉價、快速、簡便的無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析新方法。該新型的分析策略通過將捕獲抗體和化學(xué)發(fā)光探針(辣根過氧化酶,HRP)共固定于具有良好生物相容性的金納米粒子-殼聚糖(AuNPs-Chitosan)的固相復(fù)合界面,捕獲抗體與抗原的特異性結(jié)合將在傳感界面形成免疫復(fù)合物,該復(fù)合物會有效阻礙化學(xué)發(fā)光底物向HRP界面的擴散,并抑制酶催化的化學(xué)發(fā)光反應(yīng),從而引起化學(xué)發(fā)光信號的減弱。利用化學(xué)發(fā)光信號變化和目標(biāo)抗原濃度的之間的線性關(guān)系,可實現(xiàn)快速的無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光檢測。相對傳統(tǒng)的標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析,該無標(biāo)記免疫分析方法具有檢測成本低,樣品消耗少,耗費時間短,操作簡單等優(yōu)勢。用人免疫球蛋白(HIgG)作為模型分析物,該分析體系的化學(xué)發(fā)光信號和HIgG濃度成良好的線性關(guān)系,其檢測的線性范圍為0.10-80 ng/mL,線性相關(guān)系數(shù)0.9980,檢測限為0.068 ng/mL(信噪比為3)。此外,該無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫傳感器具有高的靈敏度、強的特異性、可接受的重現(xiàn)性和實際樣品檢測的準(zhǔn)確性。本文開創(chuàng)性地提出了無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析新思想,將促進(jìn)化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的革新,對疾病診斷等領(lǐng)域的發(fā)展具有重要的意義。(2)本文首次提出了一種基于硫化銅納米粒子過氧化氫模擬酶(CuSNPs)的無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。該CuSNPs模擬酶通過簡單的液相共沉淀方法合成得到,并展現(xiàn)了高效的催化活性和穩(wěn)定性。該分析策略通過將CuSNPs分散于殼聚糖溶液中,并滴涂于環(huán)氧硅烷化的玻璃片表面形成信號層,然后將捕獲抗體通過鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)修飾在信號表面形成傳感層。在線溫育抗原后,傳感界面上的抗體特異性地捕獲抗原后形成免疫復(fù)合物。該復(fù)合物能有效阻礙化學(xué)發(fā)光底物向信號界面的擴散并抑制模擬酶催化的化學(xué)發(fā)光反應(yīng),引起化學(xué)發(fā)光強度的減弱。相對于傳統(tǒng)的標(biāo)記免疫分析,該分析方法具有簡單、廉價和分析速度快等優(yōu)點。用甲胎蛋白(AFP)作為模型分析物,該無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫傳感器展現(xiàn)了寬的線性范圍(0.10-60 ng/mL),線性相關(guān)系數(shù)0.9980,檢測限為0.066 ng/mL(信噪比為3)。此外,該基于硫化銅納米模擬酶的無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫傳感器具有高的特異性和準(zhǔn)確性、良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。本文成功發(fā)展了一種新型的、可靠的、高效的無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)。(3)本文合成了一種高性能氧化銅納米過氧化氫模擬酶,首次利用其構(gòu)建了新穎的無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。氧化銅納米模擬酶改善了傳統(tǒng)化學(xué)發(fā)光免疫分析中天然酶穩(wěn)定性差、易受環(huán)境影響等缺點,顯著提高了所構(gòu)建的化學(xué)發(fā)光體系的穩(wěn)定性和靈敏度,并且大大降低了檢測費用。該基于納米模擬酶的無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光分析策略通過將氧化銅納米棒分散于殼聚糖溶液并滴涂在環(huán)氧硅烷化的玻璃片表面；再將生物素化的抗體修飾于鏈酶親和素功能化的氧化銅納米棒表面,封閉后即制得該無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫傳感器；在線溫育抗原后,特異性反應(yīng)后形成的免疫復(fù)合物能有效阻礙化學(xué)發(fā)光底物向氧化銅納米模擬酶的擴散并抑制模擬酶催化化學(xué)發(fā)光,引起化學(xué)發(fā)光強度的減弱。用癌胚抗原(CEA)作為模型分析物,該無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫傳感器展現(xiàn)了寬的線性范圍為0.10-60 ng/mL,線性相關(guān)系數(shù)0.9981,檢測限為0.048 ng/mL(信噪比為3)。該基于氧化銅納米模擬酶的無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析方法,實現(xiàn)了蛋白快速、廉價、高靈敏檢測,在臨床診斷中極具前景。(4)本文利用硫化銅納米模擬酶,發(fā)展了一種高靈敏的無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光成像多組分免疫分析新方法,用于兩種腫瘤標(biāo)志物的同時檢測。通過絲網(wǎng)印技術(shù)在可拋式環(huán)氧硅烷化的載玻片表面制得4×12免疫傳感陣列,并將分散于殼聚糖的硫化銅納米粒子滴涂于陣列微孔中。然后將不同生物素化的抗體修飾于鏈酶親和素功能化的硫化銅納米粒子表面,封閉后即制得該無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光多組分抗體傳感陣列。不同的捕獲抗體與其目標(biāo)抗原發(fā)生特異性免疫反應(yīng),形成的免疫復(fù)合物能有效阻礙化學(xué)發(fā)光底物向硫化銅納米粒子的擴散并抑制模擬酶催化的化學(xué)發(fā)光反應(yīng),從而引起化學(xué)發(fā)光信號強度的減弱,由電荷耦合檢測器CCD收集該化學(xué)發(fā)光信號。以甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)作為模型分析物,該無標(biāo)記免疫傳感陣列對AFP和CEA檢測的線性范圍分別是0.10-70和0.10-60 ng/mL,檢測限分別是0.028和0.029 ng/mL(信噪比為3)。該無標(biāo)記免疫傳感器實現(xiàn)了腫瘤標(biāo)志物廉價、快速、高通量、高靈敏的檢測,為臨床應(yīng)用提供了一個有前景的多組分免疫分析方法,具有非常重要的應(yīng)用價值和實際意義。
【關(guān)鍵詞】：無標(biāo)記 模擬酶 流動注射 化學(xué)發(fā)光 傳感陣列 免疫分析
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：O657.3
【目錄】：

• 摘要2-4
• Abstract4-11
• 第一章 前言11-30
• 1.1 免疫分析概述11-15
• 1.1.1 抗原11
• 1.1.2 抗體11
• 1.1.3 免疫分析11-12
• 1.1.4 免疫傳感器12-15
• 1.1.4.1 免疫傳感器基本原理12-13
• 1.1.4.2 免疫傳感器的分類13
• 1.1.4.3 免疫傳感器中抗原或抗體的固定方法13-15
• 1.2 化學(xué)發(fā)光15-17
• 1.2.1 化學(xué)發(fā)光概述15
• 1.2.2 化學(xué)發(fā)光分類15-16
• 1.2.3 化學(xué)發(fā)光常用體系16-17
• 1.2.4 化學(xué)發(fā)光的應(yīng)用和發(fā)展17
• 1.3 化學(xué)發(fā)光免疫分析17-19
• 1.3.1 化學(xué)發(fā)光免疫分析的基本原理17-18
• 1.3.2 無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的發(fā)展18
• 1.3.3 化學(xué)發(fā)光免疫分析與其它技術(shù)的結(jié)合18-19
• 1.4 納米材料19-20
• 1.4.1 納米材料的定義19
• 1.4.2 納米材料的特性19
• 1.4.3 納米材料在免疫傳感器中的應(yīng)用19-20
• 1.5 多組分免疫分析20-23
• 1.5.1 時間分辨多組分免疫分析20
• 1.5.2 空間分辨多組分免疫分析20-23
• 1.5.2.1 陣列檢測器21
• 1.5.2.2 空間分辨多組分免疫分析21-22
• 1.5.2.3 空間分辨多組分免疫分析的發(fā)展22-23
• 1.5.3 其它模式多組分免疫分析23
• 1.6 腫瘤標(biāo)志物23-24
• 1.7 本文的主要研究工作24
• 1.8 參考文獻(xiàn)24-30
• 第二章 基于共固定捕獲抗體和天然酶策略的無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析新方法30-44
• 2.1 實驗部分31-34
• 2.1.1 試劑與材料31
• 2.1.2 儀器31-32
• 2.1.3 納米金的合成32-33
• 2.1.4 免疫傳感器的制備33
• 2.1.5 免疫分析步驟33-34
• 2.2 結(jié)果與討論34-40
• 2.2.1 無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析方法可行性的驗證34-35
• 2.2.2 免疫傳感器的表征35-37
• 2.2.2.1 免疫傳感器的SEM表征35-36
• 2.2.2.2 免疫傳感器的阻抗表征36-37
• 2.2.2.3 免疫傳感器的接觸角表征37
• 2.2.3 免疫分析過程的優(yōu)化37-38
• 2.2.3.1 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)動力學(xué)特征37-38
• 2.2.3.2 溫育時間的優(yōu)化38
• 2.2.4 特異性研究38-39
• 2.2.5 免疫傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性39
• 2.2.6 分析性能和臨床樣品的檢測39-40
• 2.3 結(jié)論40-41
• 2.4 參考文獻(xiàn)41-44
• 第三章 基于硫化銅納米模擬酶的無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析新方法檢測甲胎蛋白44-58
• 3.1 實驗部分45-47
• 3.1.1 試劑與材料45
• 3.1.2 儀器45-46
• 3.1.3 硫化銅納米粒子的合成46
• 3.1.4 免疫傳感器的制備46
• 3.1.5 免疫分析步驟46-47
• 3.2 結(jié)果與討論47-55
• 3.2.1 無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析方法可行性的驗證47-48
• 3.2.2 硫化銅納米粒子的表征48-49
• 3.2.3 免疫傳感器的表征49-52
• 3.2.3.1 免疫傳感器的SEM表征49-50
• 3.2.3.2 免疫傳感器的XPS和FT-IR表征50
• 3.2.3.3 免疫傳感器的阻抗表征50-51
• 3.2.3.4 免疫傳感器的接觸角表征51-52
• 3.2.4 免疫分析過程的優(yōu)化52-53
• 3.2.4.1 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)動力學(xué)特征52
• 3.2.4.2 溫育時間的優(yōu)化52-53
• 3.2.5 特異性研究53-54
• 3.2.6 免疫傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性54
• 3.2.7 分析性能和臨床樣品的檢測54-55
• 3.3 結(jié)論55-56
• 3.4 參考文獻(xiàn)56-58
• 第四章 基于氧化銅納米模擬酶的無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析新方法檢測癌胚抗原58-73
• 4.1 實驗部分59-62
• 4.1.1 試劑與材料59
• 4.1.2 儀器59-60
• 4.1.3 氧化銅納米棒的合成60
• 4.1.4 免疫傳感器的制備60
• 4.1.5 免疫分析步驟60-62
• 4.2 結(jié)果與討論62-71
• 4.2.1 無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析方法可行性的驗證62
• 4.2.2 氧化銅納米棒的表征62-63
• 4.2.3 氧化銅納米棒模擬酶性質(zhì)63-64
• 4.2.4 免疫傳感器的表征64-67
• 4.2.4.1 免疫傳感器的SEM表征64-65
• 4.2.4.2 免疫傳感器的阻抗表征65-66
• 4.2.4.3 免疫傳感器的接觸角表征66
• 4.2.4.4 免疫傳感器的紅外表征66-67
• 4.2.5 免疫分析過程的優(yōu)化67-68
• 4.2.5.1 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)動力學(xué)特征67-68
• 4.2.5.2 溫育時間的優(yōu)化68
• 4.2.6 特異性研究68-69
• 4.2.7 免疫傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性69-70
• 4.2.8 分析性能和臨床樣品的檢測70-71
• 4.3 結(jié)論71
• 4.4 參考文獻(xiàn)71-73
• 第五章 多腫瘤標(biāo)志物無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光成像免疫分析新方法73-86
• 5.1 實驗部分74-76
• 5.1.1 試劑與材料74
• 5.1.2 儀器74-75
• 5.1.3 硫化銅納米粒子的合成75
• 5.1.4 免疫傳感陣列的構(gòu)建75
• 5.1.5 免疫分析步驟75-76
• 5.2 結(jié)果與討論76-83
• 5.2.1 無標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析方法可行性的驗證76-77
• 5.2.2 免疫傳感器的表征77-79
• 5.2.2.1 免疫傳感器的化學(xué)發(fā)光表征77-78
• 5.2.2.2 免疫傳感器的CV表征78-79
• 5.2.2.3 免疫傳感器的接觸角表征79
• 5.2.3 免疫分析過程的優(yōu)化79-81
• 5.2.3.1 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)動力學(xué)特征79-80
• 5.2.3.2 溫育時間的優(yōu)化80-81
• 5.2.4 特異性研究81
• 5.2.5 免疫傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性81-82
• 5.2.6 分析性能和臨床樣品的檢測82-83
• 5.3 結(jié)論83-84
• 5.4 參考文獻(xiàn)84-86
• 攻讀碩士研究生期間發(fā)表及待發(fā)表的論文86-87
• 致謝87-88

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本文編號：930482