本文關(guān)鍵詞：乳及乳制品中結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)方法—熒光定量PCR法

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【摘要】：結(jié)核分枝桿菌是引起結(jié)核病(Bovine tuberculosis)的重要人獸共患傳染病病原,一直困擾世界奶牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展,危害著人類(lèi)和動(dòng)物健康,給社會(huì)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將其列為B類(lèi)動(dòng)物傳染病,我國(guó)將其列為二類(lèi)動(dòng)物傳染病。全世界各國(guó)每年均花費(fèi)大量的人力、物力和財(cái)力去防制本病的發(fā)生。OIE指定的檢測(cè)方法是結(jié)核菌素試驗(yàn)方法,但該方法受物理、化學(xué)以及生物因素影響,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的特異性、敏感性不高;經(jīng)典的細(xì)菌分離培養(yǎng)受到分枝桿菌生長(zhǎng)緩慢的影響,檢測(cè)周期長(zhǎng)。對(duì)于出入境檢驗(yàn)檢疫,乳及乳制品中結(jié)核分枝桿菌的快速檢測(cè)方法的建立又顯得尤為重要。因此建立快速、靈敏、特異的檢測(cè)乳及乳制品中結(jié)核分枝桿菌方法對(duì)于出入境檢驗(yàn)檢疫及本病的防控具有重要意義。本研究根據(jù)結(jié)核分支桿菌保守序列設(shè)計(jì)特異引物,建立了結(jié)核分枝桿菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)法。對(duì)該方法的靈敏度、特異性和重復(fù)性進(jìn)行研究,結(jié)果表明:所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-3.29x+38.6,相關(guān)系數(shù)為0.9980;敏感性高,可達(dá)1×102 copies/μL,亦可達(dá)10CFU/5mL。抗干擾能力強(qiáng),僅結(jié)核分枝桿菌出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線。重復(fù)性良好,分別用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行組內(nèi)和組間平行試驗(yàn),結(jié)果顯示批內(nèi)和批間的變異系數(shù)均小于1%。經(jīng)大連動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心、吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局、河南出入境檢驗(yàn)檢疫局、山東出入境檢驗(yàn)檢疫局、黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局等5家單位驗(yàn)證,表明該實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法能準(zhǔn)確快速檢測(cè)乳及乳制品中結(jié)核分枝桿菌,且建立的方法已成為檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《SN/T 2101-2016出口乳及乳制品中結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)方法熒光定量PCR法》,標(biāo)準(zhǔn)將于2016年10月1日起實(shí)施。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核病 結(jié)核分枝桿菌 熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 檢測(cè)方法
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：TS252.7;O657.3
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 1 前言9-18
• 1.1 結(jié)核分枝桿菌9-16
• 1.1.1 分枝桿菌屬的分類(lèi)9-10
• 1.1.2 結(jié)核分枝桿菌生物學(xué)特征10-11
• 1.1.3 致病機(jī)制與所致疾病11
• 1.1.4 結(jié)核分枝桿菌獨(dú)特的基因組11-12
• 1.1.5 結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)的研究進(jìn)展12-16
• 1.2 熒光定量PCR16-17
• 1.3 原理17-18
• 2 材料與方法18-24
• 2.1 儀器和器材18
• 2.2 試劑18-19
• 2.3 樣品處理19
• 2.3.1 抽樣、采樣工具19
• 2.3.2 樣品采集19
• 2.3.3 樣品貯運(yùn)19
• 2.3.4 樣品制備19
• 2.4 PCR產(chǎn)物的克隆19-20
• 2.4.1 PCR產(chǎn)物的回收19
• 2.4.2 PCR產(chǎn)物與克隆載體pGEM-T的連接19-20
• 2.4.3 JM l09感受態(tài)細(xì)胞的制備20
• 2.4.4 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主菌20
• 2.5 陽(yáng)性質(zhì)粒的鑒定及序列的測(cè)定20-21
• 2.5.1 質(zhì)粒的小量提取20
• 2.5.2 序列的測(cè)定和分析20-21
• 2.5.3 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒的制備21
• 2.6 方法21-24
• 2.6.1 DNA提取21-22
• 2.6.2 樣本的處理22
• 2.6.3 反應(yīng)體系的配制22
• 2.6.4 熒光定量PCR的檢測(cè)22-23
• 2.6.5 結(jié)果判定23-24
• 3 結(jié)果與分析24-31
• 3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制24
• 3.2 特異性試驗(yàn)24-25
• 3.3 重復(fù)性試驗(yàn)25
• 3.4 敏感性試驗(yàn)25-26
• 3.5 臨床乳樣檢驗(yàn)26-27
• 3.6 驗(yàn)證試驗(yàn)27-30
• 3.7 標(biāo)準(zhǔn)的建立30-31
• 4 討論31-34
• 4.1 研究意義31-32
• 4.2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用32
• 4.3 熒光定量PCR與LAMP的應(yīng)用32-33
• 4.4 展望33-34
• 5 全文總結(jié)34-35
• 致謝35-36
• 參考文獻(xiàn)36-40
• 附錄40-47

【參考文獻(xiàn)】

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