S-2-氨基-1-苯基乙醇是一種重要的醫(yī)藥中間體,廣泛應(yīng)用于神經(jīng)遞質(zhì)及抗病毒劑等多種具有生理活性藥物的合成.目前其合成主要通過(guò)化學(xué)手段,雖然工藝成熟,但反應(yīng)條件劇烈,且會(huì)生成許多副產(chǎn)物.基于新鑒定的銅綠假單胞菌來(lái)源的ω-轉(zhuǎn)氨酶,設(shè)計(jì)了一個(gè)結(jié)合新金色分枝桿菌來(lái)源的醇脫氫酶的級(jí)聯(lián)酶催化體系,從而將較為廉價(jià)的苯基-1,2-乙二醇一步催化合成具有高附加值的S-2-氨基-1-苯基乙醇.為了解決級(jí)聯(lián)催化過(guò)程中輔酶再生和氨基供體再生問題,在該級(jí)聯(lián)體系中引入大腸桿菌來(lái)源的谷氨酸脫氫酶,構(gòu)建一個(gè)封閉的氧化還原自循環(huán)系統(tǒng),從而實(shí)現(xiàn)輔酶（NADP⁺）和輔底物（L-Glu）的同時(shí)再生.最后將這3個(gè)酶串聯(lián)表達(dá)在pETDuet和pACYCDuet質(zhì)粒上,并轉(zhuǎn)入大腸桿菌中,獲得了重組菌Escherichia coli BL21（MPG）.通過(guò)重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化,結(jié)果顯示在100 mL、pH 8.0的NH₄Cl溶液中,37℃條件下反應(yīng)10 h后,OD₆₀₀=30的該重組菌可一步催化50 mmol/L苯基-1,2-乙二醇生成光學(xué)純的S-2-氨基-1-苯基乙... 

【文章來(lái)源】：應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào). 2020,26(01)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

輔酶自循環(huán)系統(tǒng)催化合成S-2-氨基-1-苯基乙醇.

(1）溫度和pH對(duì)PAKω-TA酶活力及穩(wěn)定性的影響：純化后PAKω-TA酶液用于酶學(xué)特性研究.如圖3a所示，相對(duì)酶活力隨著pH的增加而提高，直至在pH 8.0時(shí)達(dá)到最大值.37℃溫育1 h后，酶在pH 7.0-8.0之間穩(wěn)定，并保持80%以上的相對(duì)活性.根據(jù)之前的研究表明，已報(bào)告的大多數(shù)ω-轉(zhuǎn)氨酶的最適pH值高于pH 9.0（表3)[9,26-27].然而，該堿性條件不適合醇脫氫酶和谷氨酸脫氫酶，因?yàn)樗鼈兊淖罴裵H值在7.0-8.5之間.因此，本研究中使用的PAKω-TA對(duì)于多酶級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)表現(xiàn)出很好的兼容性.溫度對(duì)PAKω-TA酶活的影響如圖3b所示.結(jié)果表明PAKω-TA的最佳反應(yīng)溫度為37℃，并且在較高溫度下酶活性會(huì)降低，這可能是由于酶在高溫下會(huì)熱失活.熱穩(wěn)定性曲線顯示PAKω-TA在37℃以下穩(wěn)定，而隨著溫度的升高，酶活性顯著下降，當(dāng)溫度達(dá)到50℃時(shí)，孵育1 h后酶活力僅保留20%.因此，PAKω-TA的最佳催化條件為37℃，pH 8.0，這也用于下一步的酶轉(zhuǎn)化或全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化.

級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)進(jìn)程如圖5a所示，當(dāng)加入足夠的輔底物L(fēng)-Glu和輔因子NADP+時(shí)，前2 h內(nèi)MnADH能快速催化苯基-1,2-乙二醇生成S-羥基苯乙醛，然后再在PAKω-TA的作用下將S-羥基苯乙醛轉(zhuǎn)化為S-2-氨基-1-苯基乙醇，而2 h后產(chǎn)物的生成速率逐漸降低，4 h時(shí)產(chǎn)物已不再增加，最終的生成S-2-氨基-1-苯基乙醇的量為28.5 mmol/L，底物苯基1,2-乙二醇也有20 mmol/L剩余.通過(guò)檢測(cè)催化反應(yīng)過(guò)程中pH的變化，結(jié)果如圖5b所示，反應(yīng)過(guò)程中pH在不斷下降，這是由于輔底物L(fēng)-Glu脫氨生成2-酮戊二酸（2-OG），使反應(yīng)液pH降低，因此猜測(cè)底物轉(zhuǎn)化率不高的原因可能是由于反應(yīng)過(guò)程中pH不斷下降，導(dǎo)致酶活力受到抑制，從而使反應(yīng)終止.圖5 MnADH、PAKω-TA純酶催化合成S-2-氨基-1-苯基乙醇驗(yàn)證及中間過(guò)程pH變化情況.


本文編號(hào)：3441094