X射線衍射晶體學(xué)是解析生物大分子結(jié)構(gòu)的重要技術(shù)手段之一,廣泛用于酶的三維結(jié)構(gòu)解析。通過解析酶以及酶/小分子復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu),結(jié)合分子動力學(xué)的研究,可以獲取酶與小分子的相互作用機(jī)制,并在分子水平上探究酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,為進(jìn)一步對酶的理性改造提供結(jié)構(gòu)依據(jù)。DehDIV-R是本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的R-2-鹵代酸脫鹵酶,產(chǎn)自假單胞菌ZJU6,能專一性地水解R-2-氯丙酸,具有重要的應(yīng)用前景。目前關(guān)于R-2-鹵代酸脫鹵酶的晶體結(jié)構(gòu)報道較少,對于其底物立體選擇性研究也僅僅在R,S-2-鹵代酸脫鹵酶的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上間接進(jìn)行解釋。本文通過多步層析法制備得到高純度的DehDIV-R蛋白,采用懸滴氣相擴(kuò)撒法,在0.1 mol/HEPES（pH 7）,12%PEG 6000,0.2 mol/l MgC12,8mmol/LCHAPS條件下獲得高質(zhì)量晶體,并在上海同步輻射光源收集到一套分辨率為2.35 A的數(shù)據(jù),采用CCP4 online服務(wù)器分子置換法解析得到DehDIV-及的晶體結(jié)構(gòu)。基于結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果顯示,DehDIV-R是由多個α螺旋組成的假二聚體結(jié)構(gòu),且活性中心Asp205與Asn131形成氫鍵,有利于Asp2... 

【文章來源】：浙江大學(xué)浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１．２冷凍電鏡技術(shù)分辨率的發(fā)展??Ｆｉｇ．?１．２?Ｔｈｅ?ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ?ｏｆ?ｃｔｙｏ－ｅｌｅｃｔｒｏｎ?ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ??

作用的一種膜蛋白ＴＲＰＶ１的結(jié)構(gòu)從而使得冷凍電鏡技術(shù)在蛋白質(zhì)（尤其是??膜蛋白）的結(jié)構(gòu)解析上得到重視，并標(biāo)志著冷凍電鏡正式進(jìn)入“原子分辨率”時代，??見圖１．２。２０１７年諾貝爾化學(xué)獎授予了在用冷凍電鏡解析溶液中生物大分子高分??辨率結(jié)構(gòu)方法學(xué)方面做出貢獻(xiàn)的Ｊａｃｑｕｅｓ?Ｄｕｂｏｃｈｅｔ、Ｊｏａｃｈｉｍ?Ｆｒａｎｋ和Ｒｉｃｈａｒｄ??Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ?〇??ｂｅｆｏｒｅ?２０１３??圖１．２冷凍電鏡技術(shù)分辨率的發(fā)展??Ｆｉｇ．?１．２?Ｔｈｅ?ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ?ｏｆ?ｃｔｙｏ－ｅｌｅｃｔｒｏｎ?ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ??Ｘ射線衍射晶體法，用波長與原子間距離相近的Ｘ射線照射單晶，從而形??成衍射圖譜。利用計算機(jī)輔助分析衍射點(diǎn)的強(qiáng)度、位置和圖案等信息，并從中推??斷出各個原子的位置信息，最終解析得到晶體結(jié)構(gòu)，見圖１．３。１８９５年Ｒｏｎｔｇｅｎ??發(fā)現(xiàn)了?Ｘ射線。１９１３年Ｂｒａｇｇ父子提出了晶體衍射理論以及著名的Ｂｒａｇｇ方程??（２ｄｓｉｎｅ＝ｒａ），奠定了理論基礎(chǔ)。１９５３年Ｗａｓｔｏｎ和Ｃｒｉｃｋ基于ＤＮＡ的Ｘ射線衍??射圖，推斷出ＤＮＡ的雙螺旋結(jié)構(gòu)。１９５７年和１９５９年Ｋｅｎｄｒｅｗ和Ｐｅｒｕｔｚ分別通??過Ｘ射線衍射晶體法解析得到肌紅蛋白和血紅蛋白的結(jié)構(gòu)。Ｘ射線衍射晶體法??由于分辨率高，是蛋白結(jié)構(gòu)解析的重要手段，但高衍射質(zhì)量的蛋白晶體的制備始??終是其發(fā)展的瓶頸之一。??ｒ……二二二？?．．．?Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ??■Ｓ＿＇＇?

Ｘ射線衍射晶體法用于解析蛋白結(jié)構(gòu)的常規(guī)流程包括：蛋白的表達(dá)與純化、??蛋白單晶的培養(yǎng)、Ｘ射線衍射數(shù)據(jù)的收集與處理、相角的獲得、初始結(jié)構(gòu)的搭建??與精修，見圖１．４。其中主要難點(diǎn)在于蛋白單晶以及相角的獲得。??ｃｒｙｓｔａｌ??Ｍ?１??Ｃｌｏｎｉｎｇ?ａｎａ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｉ?ｔｈｅ?＾?ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ??ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｐａｔｔｅｒｎ??＼?Ｉ??Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ??■Ｉ?ｈ｜＿§?ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ?ａｎｄ?ｆｉｔｔｉｎｇ?■??ｉ?ＪｌＡ?辦?ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ??ａ＾ｅ??Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ??圖１．４Ｘ射線衍射晶體法解析流程??Ｆｉｇ．?１．４?Ｔｈｅ?ｐｒｏｃｅｓｓ?ｏｆ?Ｘ－ｒａｙ?ｃｎ?ｓｔａｌ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ａｎａｌｙｓｉｓ??（ｉ）蛋白結(jié)晶??蛋白結(jié)晶是溶液中過飽和度的推動使得無序排列的蛋白以一定規(guī)律堆積而??形成有序集合體的過程［９］。蛋白晶體內(nèi)部除了蛋白質(zhì)分子外還有４０％？６０％的溶??劑，從而導(dǎo)致蛋白晶體易碎且容易出現(xiàn)不規(guī)則排列。蛋白結(jié)晶是一個多因素控制??的過程，可分為物理因素、化學(xué)因素以及生物因素三大類【１Ｑ］，目前還無法直接預(yù)??測蛋白結(jié)晶的生長條件，見表１．１。??批量結(jié)晶法、氣相擴(kuò)散法和透析法等是目前常用的蛋白結(jié)晶方法，且研究較??透徹，發(fā)展較成熟。批量法是將蛋白與結(jié)晶試劑在密閉環(huán)境中直接混合出預(yù)期的??過飽和度從而實(shí)現(xiàn)結(jié)晶。該方法操作簡單，但需要的目標(biāo)蛋白量較大，適用于工??業(yè)化的結(jié)晶［１１１。而氣相擴(kuò)散法常用于實(shí)驗(yàn)室微量結(jié)晶條件的篩選

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
[1]C2/C3鹵代酸脫鹵酶的篩選及克隆表達(dá)[D]. 林春嬌.浙江大學(xué) 2011

碩士論文
[1]脂肪酶PaL和脫鹵酶DehDIV-R的結(jié)構(gòu)解析[D]. 沈丹丹.浙江大學(xué) 2016



本文編號：3315696