蛋白質(zhì)作為承載生物功能的重要載體,在生命活動中發(fā)揮著極其關(guān)鍵的作用。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)并揭示了很多重要蛋白的生理功能與調(diào)控機(jī)制,極大地促進(jìn)了我們對生命活動機(jī)制的理解。目前大多數(shù)關(guān)于蛋白質(zhì)的研究是基于傳統(tǒng)的生化方法,這些方法主要在溶液體系中進(jìn)行,溶液體系簡單可控,給研究帶來了種種便利。然而,細(xì)胞作為組成生命體的最小單元,其復(fù)雜性遠(yuǎn)超出了人們的想象,因此在溶液中得到的研究結(jié)果不一定能夠真實地反映蛋白在細(xì)胞內(nèi)的存在狀態(tài)。此外,絕大多數(shù)細(xì)胞外溶液體系的研究結(jié)果是建立在對細(xì)胞群體研究的基礎(chǔ)上,忽略了細(xì)胞個體間的異質(zhì)性（Cellular Heterogeneity）。這必然會導(dǎo)致生物信息的稀釋或丟失,甚至?xí)贸雒艿慕Y(jié)論。熒光相關(guān)光譜（FCS）及其相關(guān)技術(shù)是近年來發(fā)展的單分子檢測方法,其具有靈敏度高,空間分辨率高,非侵入性檢測等優(yōu)點。這使得FCS及其相關(guān)技術(shù)非常適合在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行蛋白濃度、擴(kuò)散行為、寡聚化和相互作用等研究。同時熒光相關(guān)光譜適合在單個活細(xì)胞水平甚至是在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)水平進(jìn)行測定。本論文以熒光蛋白作為探針標(biāo)記目標(biāo)蛋白分子,同時構(gòu)建了能夠?qū)崿F(xiàn)在線細(xì)胞培養(yǎng)、高分辨率成像以及活細(xì)胞原位熒光相關(guān)... 

【文章來源】：上海交通大學(xué)上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：151 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

FCS系統(tǒng)示意圖

0圖 1-2 FCCS 系統(tǒng)示意圖Figure 1-2 Schematic diagram of FCCS setup2 FCCS 系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)典型的共聚焦 FCCS 系統(tǒng)如圖 1-2 所示，由兩路激光器發(fā)出的兩束不同波長激元件進(jìn)行空間光合束或者是光纖耦合合束后，通過擴(kuò)束鏡擴(kuò)束，然后被二色鏡鏡，兩束激光聚焦于樣品中的同一位置，激發(fā)樣品聚焦體積內(nèi)的兩種熒光粒子兩種不同波長的熒光信號。物鏡一般選擇高數(shù)值孔徑的水浸物鏡，在樣品中形小的檢測微區(qū)，通常小于 1 fL。由于兩種熒光粒子在溶液中作布朗運動進(jìn)出檢造成微區(qū)內(nèi)兩種熒光信號的漲落。由樣品產(chǎn)生的熒光信號被同一物鏡收集，透

圖 2-1 FCS 裝置示意圖Figure 2-1 The setup of a FCS system.2.3.13 FCS 在活細(xì)胞中的測定方法在 FCS 測定前，首先在 488 nm 激光激發(fā)下使用壓電陶瓷掃描裝置對細(xì)胞進(jìn)行方向掃描。帶有 x-y 坐標(biāo)信息的熒光光強(qiáng)信號被 FCS 系統(tǒng)收集，通過自行編寫的 M程序?qū)⑦@個光強(qiáng)信號轉(zhuǎn)換為高分辨率的細(xì)胞掃描成像圖。該圖具有 x-y 坐標(biāo)位置信能夠通過控制掃描裝置，將鏡頭移動到特定的位置收集 FCS 信號。FCS 通常連續(xù)測定 5 次，每次 10s。因為在每次測定的過程中會由于光漂白造光分子數(shù)逐漸減少，所以我們?nèi)?5 次測定中的第一次數(shù)據(jù)進(jìn)行濃度計算。對于擴(kuò)散的計算，我們選擇后四次的測定數(shù)據(jù)，因為在第一次測定時會將那些不太運動的熒子漂白。測定得到的 FCS 數(shù)據(jù)通過 Microcal Origin 8.0 軟件進(jìn)行非線性擬合。通過


本文編號：3259068