類胡蘿卜素是一類以異戊二烯為結構單元,有著廣泛應用的高附加值萜類化合物。而蝦青素是一種重要的類胡蘿卜素,且是類胡蘿卜素合成當中的最高級別產(chǎn)物,具有超強的抗氧化、消除活性單線態(tài)氧的作用,在食品、化妝品、保健品領域也有著廣泛的應用前景。在蝦青素代謝途徑中,蝦青素的合成與β-胡蘿卜素酮酶(CrtW)和β-胡蘿卜素羥化酶(CrtZ)有著密不可分的關系,這兩種酶的活性與底物的偏好性直接關系到蝦青素的產(chǎn)量。CrtW,CrtZ是蝦青素合成途徑中兩個關鍵酶,也是代謝工程當中的兩個主要的靶點。本研究以大腸桿菌為細胞工廠,對蝦青素合成途徑中的關鍵基因簇crtW-crtZ進行系統(tǒng)優(yōu)化,主要目的是獲得高水平合成蝦青素的工程菌株。首先篩選并克隆了真核和原核微生物不同來源的crtW、crtZ基因,進一步將這些基因插入表達載體pCA12上,最后導入已敲除內毒素基因并過量表達β-胡蘿卜素合成途徑的大腸桿菌GY02進行異源表達。對發(fā)酵溫度進行優(yōu)化,確定了在30℃進行自誘導和生物轉化。通過比較篩選獲得了三組相對較好的crtW-crtZ基因組合:來源短波單胞菌的crtW和菠蘿泛菌的crtZ組合(即BreW-PanZ)、來源土壤農桿菌的crtW和crtZ組合(即AauW-AauZ),以及來源雨生紅球藻的crtW和土壤農桿菌的crtZ基因組合(即W148-AauZ)。這三種組合有利于蝦青素的積累,對應的菌株為LY01、LY03和LY05,產(chǎn)量分別為 11.83 mg/g DCW,9.24 mg/g DCW,11.79 mg/g DCW。由于上述構建的蝦青素報告質粒過大(除了攜帶兩個關鍵基因,還有β-胡蘿卜素合成途徑的基因),故采取以下方式進行優(yōu)化:將BreW-PanZ組合連接在四種不同拷貝數(shù)的表達質粒上,然后分別與pCA12質粒共轉化大腸桿菌GY02宿主進行異源表達,這樣可以減少質粒丟失現(xiàn)象,同時篩選出合適的質�？截悢�(shù)。實驗結果證明BreW-PanZ基因簇與中高拷貝或高拷貝質粒的適配性更好,大幅度減少了質粒丟失的現(xiàn)象,產(chǎn)量分別為10.6 mg/gDCW,10.3 mg/g DCW。由于異戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)是是萜類化合物合成途徑中的兩個關鍵的代謝中間物,也是大腸桿菌中2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸合成途徑(MEPpathway)和外源甲羥戊酸途徑(MVA pathway)的交匯處,調控著整個萜類代謝途徑,而異戊烯基焦磷酸異構酶(IDI)是調節(jié)萜類前體物質IPP和DMAPP的異構酶,在整個代謝途徑中具有重要的意義,也是代謝工程的主要靶點之一。因此本研究利用CRISPR手段在大腸桿菌染色體上整合了一個拷貝的idi基因,將不同來源基因組合的crtW-crtZ報告質粒轉化此細胞中再次進行篩選,對菌株產(chǎn)蝦青素能力進行檢測后,發(fā)現(xiàn)過表達idi對來源土壤農桿菌的crtW和菠蘿泛菌的crtZ(即AauW-PanZ)基因組合產(chǎn)蝦青素有很大幫助,從原來的4.45 mg/gDCW提高到12.25 mg/gDCW,產(chǎn)量提高了 2.75倍。對LY01菌株進行高密度培養(yǎng),發(fā)酵培養(yǎng)45.5h,菌體密度OD600可以達到183,蝦青素單位干重產(chǎn)量為8.43 mg/g,與搖瓶發(fā)酵的產(chǎn)量(干重11.83 mg/g)相比減少了 28.7%。但高密度發(fā)酵有其特有的優(yōu)勢,單位體積產(chǎn)量由搖瓶產(chǎn)量的35.92 mg/L增加到發(fā)酵罐產(chǎn)量的455.68 mg/L,單位體積產(chǎn)量提高了 11.69倍。
【學位單位】：廣西大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：TQ920.1;O629.4
【部分圖文】：

圖１－２蝦青素的合成途徑??Ｆｉｇｌ－２?Ｔｈｅ?ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ?ｐａｔｈｗａｙ?ｏｆ?ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ??

ｋｉｎａｓｅ，ＭＶＫ）、憐酸甲輕戊酸激酶（Ｐｈｏｓｐｈｏｍｅｖａｌｏｎａｔｅ?ｋｉｎａｓｅ，ＰＭＫ）和?ＰＰＭｅｖ??脫竣酶（Ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｍｅｖａｌｏｎａｔｅｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓ，ＭＶＤ）的催化下生成前體物質異戊??烯基焦磷酸（ＩＰＰ），如圖１－３。經(jīng)ＩＰＰ異構酶（ＩＤＩ）的作用，ＩＰＰ與ＤＭＡＰＰ兩??種前體物質之間進行異構化，最終進入下游產(chǎn)物的合成途徑［６］，如圖１－２。??６??

３０?ｍｉｎ，流動性Ｂ的濃度－？立控制在０，總流速為０．５?ｍＬ／ｍｉｎ。采州紫夕卜檢測器??在最大吸收值４７５?ｎｍ處測吸收峰面積，再根據(jù)標準曲線計算蝦青素的產(chǎn)量。以??蝦青素濃度為橫坐標，液相峰面積為縱坐標，標準曲線如圖２－２。??？２５００００?｜？峰面積??？?２３３０８５??ｖ?＝?Ｓ）８２０８ｘ－９８３３．５?乂??２０００００?■?Ｒ－＝?０．９９９７??ｖ？１７２０７６??ｉｓｏｏｏｏ?－??ｍ＾ＵＡＳＯｌ??１０００００?＊??５００００?？?ＪＩ５０７４１??蝦Ｗ素濃度（ｍｇ／Ｌ）??■?１９４６５??（）＇？■？？？？??ｏ?ｏ．ｓ?ｉ?ｉｓ?ｉ?２．ｒ＞?３??圖２－２蝦青素標準曲線??Ｆｉｇ．２－２?Ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ?ｓｔａｎｄａｒｄ?ｃｕｒｖｅ??由圖２－２可知，此標準曲線的回歸方程為：ｙ＝９８２０８ｘ－９８３３．５，相關系數(shù)??Ｒ２＝０．９９９７。相關系數(shù)在０．９９９以上，表明其相關性良好，可川于定量分析蝦青??素濃度。??２９??
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本文編號：2892844