抗體是重要的生物藥物和免疫診斷試劑,具有巨大的市場需求。基于蛋白A親和層析的傳統(tǒng)抗體分離方法存在成本高昂、配基泄露、洗脫條件苛刻等局限,制約了抗體產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。疏水性電荷誘導(dǎo)層析(Hydrophobic charge induction chromatography,HCIC)作為一種新型抗體分離方法,具有吸附容量大、選擇性較高、分離條件溫和、成本較低等優(yōu)點(diǎn),具有良好的抗體分離應(yīng)用潛力,但相關(guān)機(jī)理認(rèn)識需要進(jìn)一步加強(qiáng)。本文以商業(yè)化HCIC介質(zhì)MEPHyperCel和三種新型HCIC介質(zhì)(MMI、ABI和W-ABI介質(zhì))為主要研究對象,以靜態(tài)吸附和等溫滴定量熱法(Isothermal titration calorimetry,ITC)為主要研究手段,考察了四種HCIC介質(zhì)的蛋白吸附性能,并從熱力學(xué)角度揭示HCIC介質(zhì)的作用機(jī)理,為分離過程優(yōu)化和新型配基設(shè)計提供重要依據(jù)。首先,考察了 MEPHyperCel介質(zhì)的蛋白吸附性能研究。MEPHyperCel介質(zhì)對三種抗體(hIgG、bIgG和mAb)的吸附容量均遠(yuǎn)大于兩種血清白蛋白(HSA和BSA),體現(xiàn)出抗體分離的應(yīng)用潛力。MEPHyperCel吸附具有較強(qiáng)的pH依賴性和一定的耐鹽吸附特性。添加辛酸鈉能夠明顯降低MEPHyperCel對BSA的吸附量,提高對IgG的選擇性。實驗發(fā)現(xiàn),同時加入辛酸鈉和一定濃度的NaCl,能夠顯著減少M(fèi)EPHyperCel介質(zhì)對BSA的吸附。溫度升高也會一定程度減少BSA的吸附。在吸附實驗基礎(chǔ)上,利用ITC對辛酸鈉、MEP配基和MEP介質(zhì)與蛋白相互作用進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)辛酸鈉-BSA間的相互作用大于辛酸鈉-IgG,且辛酸鈉-BSA相互作用以疏水作用為主。加入辛酸鈉同時加入一定濃度NaCl,或者升高溫度,會使辛酸鈉與BSA間的疏水作用增強(qiáng)。同時,ITC結(jié)果表明,IgG與MEP配基之間的親和力遠(yuǎn)高于白蛋白,且MEP-IgG間同時存在疏水作用、靜電作用、氫鍵、范德華力等多種作用力。pH變化顯著影響MEP與IgG之間的靜電作用和疏水作用,導(dǎo)致MEP HyperCel介質(zhì)對hIgG的吸附容量有較大的變化。此外,ITC結(jié)果揭示了 MEPHyperCel介質(zhì)耐鹽吸附特性的熱力學(xué)機(jī)制,即MEP配基與hIgG相互作用的過程中存在熵焓補(bǔ)償現(xiàn)象,使得反應(yīng)自由能的變化不大。其次,考察了三種新型HCIC介質(zhì)(MMI、ABI和W-ABI介質(zhì))的吸附性能研究。中性pH條件下,三種新型HCIC介質(zhì)對hIgG均有較高的吸附容量,其中含有雙功能配基的W-ABI介質(zhì)對hIgG的吸附力最強(qiáng),ABI介質(zhì)次之,MMI介質(zhì)最弱。三種介質(zhì)同樣體現(xiàn)出較明顯的pH依賴性吸附特性和較好的耐鹽吸附性能。相對而言,W-ABI介質(zhì)的pH敏感性比另外兩種介質(zhì)弱。50%體積濃度的乙二醇可以較明顯地降低MEP HyperCel、MMI和ABI介質(zhì)的飽和吸附容量,但對W-ABI介質(zhì)的吸附性能影響不大。1 M精氨酸濃度下,四種HCIC介質(zhì)的吸附容量均有所減小,但整體變化幅度不大,說明精氨酸對這四種介質(zhì)的蛋白解吸促進(jìn)作用并不明顯。最后,對新型HCIC介質(zhì)-蛋白相互作用進(jìn)行了 ITC研究�？疾炝瞬煌琾H、NaCl濃度、乙二醇濃度和精氨酸濃度下,MMI、ABI和W-ABI與hIgG之間的相互作用,并與MEP HyperCel介質(zhì)進(jìn)行對比。發(fā)現(xiàn)pH對介質(zhì)-蛋白相互作用的影響顯著,不同介質(zhì)的NaCl影響略有不同,加入乙二醇會屏蔽介質(zhì)-蛋白間的疏水作用,而精氨酸的加入則會屏蔽靜電作用。中性pH條件下,MMI、ABI和W-ABI介質(zhì)均通過混合作用模式實現(xiàn)抗體的結(jié)合。其中,MMI介質(zhì)的親硫作用和疏水作用較強(qiáng),靜電作用較弱;ABI介質(zhì)與MEP HyperCel介質(zhì)的作用機(jī)理相近,但疏水作用的貢獻(xiàn)要大于MEP HyperCel介質(zhì);W-ABI介質(zhì)與hIgG間的作用力比較強(qiáng),導(dǎo)致W-ABI介質(zhì)具有很好的耐鹽吸附性能,但對pH的依賴性沒有其它三種介質(zhì)高。本文以了解HCIC介質(zhì)的蛋白吸附性能和作用機(jī)理為出發(fā)點(diǎn),探討了 pH、鹽和特殊添加劑對吸附性能的影響,通過ITC實驗探討了 HCIC介質(zhì)與抗體之間的相互作用,揭示了 HCIC介質(zhì)的作用機(jī)理,為層析分離的過程優(yōu)化和新型配基的設(shè)計提供重要的依據(jù)。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：O647.3
【部分圖文】：

Ｆｉｇ．?１．１?Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ?Ｇ．??ＩｇＧ的分子量約為１５０ｋＤａ，由四個多肽鏈組成，兩條重鏈（約５０ｋＤａ）和兩條輕鏈??（約２５ｋＤａ）通過二硫鍵連接而形成Ｙ形結(jié)構(gòu)［４１，４２］（如圖１．１）。根據(jù)組成氨基酸的可變??性，重鏈和輕鏈可進(jìn)一步分為恒定區(qū)（ｃｏｎｓｔａｎｔｒｅｇｉｏｎ，Ｃ區(qū)）和可變區(qū)（ｖａｒｉａｂｌｅ?ｒｅｇｉｏｎ，??Ｖ區(qū)）。可變區(qū)域可進(jìn)一步細(xì)分為變異性高的氨基酸組成的高變區(qū)（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ?ｒｅｇｉｏｎ，??ＨＶ區(qū)）和相對保守的氨基酸序列組成的骨架區(qū)（ｆｒａｍｅｗｏｒｋｒｅｇｉｏｎ，ＦＲ）。ＨＶ區(qū)可以表??面互補(bǔ)的方式結(jié)合抗原，因此也稱為互補(bǔ)決定區(qū)（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ?ｒｅｇｉｏｎ，??２??

使得抗體結(jié)合于ＭＥＰ介質(zhì)上［６４］。當(dāng)調(diào)節(jié)溶液ｐＨ至４．８以下，配基上的氮原子被質(zhì)子化，??使得配基帶正電，與同樣帶正電荷的抗體發(fā)生靜電排斥作用，實現(xiàn)洗脫。??ＭＥＰ介質(zhì)與抗體分子之間的作用機(jī)制示意圖如圖１．３聽示。??＾翁??ＭＥＰ?ｌｉｇａｎｄ?ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ?ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ?ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ?ｒｅｐｕｌｓｉｏｎ??ａｎｄ?ｈｙｄｒｏｇｅｎ?ｂｉｎｄｉｎｇ?ａｔ?ａｃｉｄｉｃ?ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ??ａｔ?ｎｅｕｔｒａｌ?ｐＨ??圖１．３ＭＥＰＨｙｐｅｒＣｅｌ分離抗體的作用機(jī)制??Ｆｉｇ．?１．３?Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ?ｍｅｃｈａｎｉｓｍ?ｏｆ?ＭＥＰ?ＨｙｐｅｒＣｅｌ?ｆｏｒ?ａｎｔｉｂｏｄｙ??１．３．２疏水性電荷誘導(dǎo)層析的功能配基??ＨＣＩＣ介質(zhì)的配基一般是一些帶有疏水性或芳香性的基團(tuán)，如吡啶和咮唑等含氮雜環(huán)??基團(tuán)，可以通過調(diào)節(jié)ｐＨ來改變其帶電屬性。表１．２中列出了一些近年來文獻(xiàn)中報道的??ＨＣＩＣ功能配基。??１９９８年，Ｂｕｒｔｏｎ等［８］報道了?４－巰乙基吡啶、２－巰基－１－曱基咮唑、４－氨曱基吡啶、２－??氨乙基吡啶四種ＨＣＩＣ配基，并用于分離蛋白質(zhì)。Ｂｕｒｔｏｎ等比較了氨基類、羧基類和硫??醇類這三類ＨＣＩＣ配基，發(fā)現(xiàn)硫醇類配基的偶聯(lián)反應(yīng)過程更筒單，更具有優(yōu)勢。Ｃｏｆｆｉｎｉｅｒ??８??

和熵變Ａ５等。ＩＴＣ可以用于測定吸附過程中熱量變化，并且給出熱力學(xué)參數(shù)信息，從而??了解蛋白與配基以及蛋白與介質(zhì)之間的作用機(jī)理。??圖１．４展示了英國馬爾文儀器公司的三款ＭｉｃｒｏＣａ丨系列等溫滴定量熱儀，其中實驗??室較為常用的是ＭｉｃｒｏＣａｌ?ＶＰ－ＩＴＣ這一型號。??ＭｉｃｒｏＣａｌ?ＰＥＡＱ－１ＴＣ?Ａｕｔｏｍａｔｅｄ?ＭｉｃｒｏＣａｌ?ＰＥＡＱ－ＩＴＣ?ＭｉｃｒｏＣａｌ?ＶＰ－ＩＴＣ??ｍ??ｒ：?．?；ｉ?，、．，１?】?Ｚ?｜??■?…ｙ??圖１．４?ＭｉｃｒｏＣａｌ系列等溫滴定量熱儀??Ｆｉｇ．?１．４?ＭｉｃｒｏＣａｌ?ＩＴＣ?ｆｒｏｍ?Ｍａｌｖｅｒｎ?Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ?Ｌｔｄ．??等溫滴定量熱儀的基本工作原理如圖１．５所示［１２汍上半部分的注射器（ｓｔｉｒｒｉｎｇ?ｓｙｒｉｎｇｅ）??中裝有待滴定的溶液，注射器同時具有滴定和攪拌的功能，可使反應(yīng)更快地迗到平衡。??下半部分的絕熱殼中有參比池（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｃｅｌｌ）和樣品池（ｓａｍｐｌｅｃｅｌｌ），參比池中裝滿緩??沖液（或超純水），樣品池裝入被滴定的溶液。滴定開始前，同時給兩個池子加熱，保證??溫度相同
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本文編號：2892392