赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)是由各種曲霉屬和青霉屬等真菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物,廣泛存在于谷物和食品中,對人類和動物都有很大的危害。核酸適配體是通過指數(shù)富集的配體進化技術(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)經(jīng)體外篩選得到的單鏈寡核苷酸(ssDNA或RNA),它們可通過自身形成特定復雜的空間三維結構以高親和力和特異性結合靶標分子。本研究通過改良的氧化石墨烯(Graphene Oxide,GO)的SELEX篩選方法,獲得OTA的核苷酸適配體,結合GO淬滅熒光和膠體金分光光度法技術,構建了兩種基于適配體識別OTA的快速靈敏的檢測方法。首先,基于GO吸附單鏈寡核苷酸ssDNA的原理,采用免固定化的GO-SELEX方法篩選OTA毒素適配體。經(jīng)過10輪篩選獲得適配體富集文庫,經(jīng)克隆測序后得到23條適配體候選序列,經(jīng)一級、二級結構,親和性和特異性分析,得到一條特異識別OTA毒素的最佳適配體Seq.14,其解離常數(shù)為138.9±4.9 nmol/L。其次,基于羧基熒光素(FAM)標記的適配體與GO之間的熒光共振能量轉移(FRET)技術,構建了一種熒光傳感器。當無OTA存在時,FAM標記的適配體被GO吸附并淬滅其熒光信號;當有OTA存在時,適配體與OTA結合,從GO上脫落,引起熒光的重新恢復。在最優(yōu)條件下,OTA毒素濃度在20～3000nmol/L之間與熒光強度呈線性相關性(R2=0.995),檢測限為21.8nmol/L,加標回收率范圍在96.0～119.7%之間,相對標準偏差為3.8%。該方法可用于紅酒樣品中OTA毒素的檢測。最后,基于核酸適配體對靶標的特異性和膠體金分光光度法的靈敏性,建立了一種簡單快速檢測OTA的方法。利用核酸適配體能夠抑制膠體金在高鹽溶液中的聚集,當OTA存在時,其與適配體特異性結合,使膠體金發(fā)生聚集,膠體金的顏色發(fā)生變化。在最優(yōu)的條件下,吸光度的比值(A656nm/A520nm)與OTA濃度在0～300 ng/mL的范圍內呈良好的線性關系,其線性回歸方程為y=0.001x+0.2264,線性相關系數(shù)R2為0.9962,加標回收率為99.2～103.1%,相對標準偏差為4.4%。該方法穩(wěn)定性和重復性較好,可作為OTA的快速檢測方法。
【學位單位】：天津科技大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：Q503;O657.3
【部分圖文】：

天津科技大學碩士學位論文ＯＴＡ的特異性識別能力，雜交鏈反應模擬脫氧核酶技術開發(fā)了一種比色法檢測ＯＴＡ。該方法的線性范圍至?０．０１?ｎｍｏｌ／Ｌ。??的有效性已經(jīng)被廣泛證實，通過物質所具有的的特性質進行定性定量分析。Ｑｉａｎ等利用ＦＲＥＴ原則，設過熒光傳感和肉眼觀察雙重模式檢測ＯＴＡ。Ｌｖ等測雙鏈ＤＮＡ這一特定性，建立了一種ＯＴＡ檢測方法。其互補鏈配對形成雙螺旋結構，通過ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ作為指部分適配體與ＯＴＡ結合，加入其互補鏈與ＰｉｃｏＧｒｅｅｎＡ的適配體雜交形成雙螺旋結構，ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ插入到雙號。根據(jù)熒光信號與ＯＴＡ濃度的相關性，定量檢測Ｏ檢測范圍超過５個數(shù)量級。??

Ａｐｔａｍｅｒ?Ｏｃｈｒａｔｏｘｉｎ?Ａ?Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ?ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ??ｓｔｒａｎｄ??圖１－２無標記焚光檢測ＯＴＡ示意圖??Ｆｉｇ．?１－２?Ｌａｂｅｌ－ｆｒｅｅ?ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ?ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ?ＯＴＡ??經(jīng)典的電化學傳感器是以電極表面作為一個固定化傳感元件的平臺，結合在其上??面的分析物通過對電流、電位或電阻變化的監(jiān)控來進行檢測。Ｌｉｎｇ等Ｈ｜］基于金納米粒??子（ＡｕＮＰｓ）共價結合石墨烯片的電化學阻抗用于檢測皮摩爾級ＯＴＡ，原理如圖丨－３：金??納米顆粒共價鍵合還原氧化石墨烯（ＡｕＮＰｓ－ｒＧＯ）在石墨烯片上產(chǎn)生了大量分散良好??的ＡｕＮＰ，其具有巨大的ＤＮＡ結合位點，因為單個ｒＧＯ片和每個ＡｕＮＰ可以裝載數(shù)??百個ＤＮＡ鏈。制作了一個夾心模型的適體傳感器，其中包含固定在金電極上的硫化??的捕獲ＤＮＡ以捕獲適配體，然后將傳感界面與所需濃度的ＯＴＡ共同孵育，后將??ＡｕＮＰｓ－ｒＧＯ官能化的ＤＮＡ與殘留的適配體雜交。通過信號放大平臺，檢測電荷轉移??電阻（Ｒｃｔ）〇該方法檢測限為０．３?ｐｇ／ｍＬ或０．７４?ｐｍｏｌ／Ｌ。Ｈｕａｎｇ等［４２］基于滾環(huán)擴增技術??（ＲＣＡ）來實現(xiàn)電化學信號擴大進而進行檢測ＯＴＡ。其原理是：用于ＲＣＡ的引物由兩??部分組成，一部分為ＯＴＡ的核酸適配體，而另一部分與電極表面上的捕獲探針互補。??當ＯＴＡ存在時

能夠被ＧＯ保護抵抗不受核酸酶降解，當ｓｓＤＮＡ脫離ＧＯ表面后，由于不再受到??ＧＯ的保護，能被核酸酶的降解。除此之外，ＧＯ同樣能夠對ＲＮＡ產(chǎn)生保護能力�；�??于ＧＯ對核酸分子的保護效果，建立了?ＧＯ穩(wěn)定ＲＮＡ的方法，其原理如圖１－４所示，??并基于該方法發(fā)展了?ＲＮａｓｅ?Ｈ輔助的信號放大方法用于檢測ＤＮＡ，檢測限為０．１??ｐｍｏｌ／Ｌ〇??＊■?ｒ＼１Ｂ?＜３＾?ＩＳｕｒｌｅａｗ，?ｆ?＼／?＼?Ｔａｒｇｅｔ??圖１－４?ＧＯ保護ＲＮＡ探針的原理??Ｆｉｇ．?１－４?Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ?ｏｆ?ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ＲＮＡ?ｐｒｏｂｅ?ｗｉｔｈ?ＧＯ??１．４．２納米金粒子??納米金（ｇｏｌｄ?ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ，ＡｕＮＰｓ），是一種直徑１￣１００?ｎｍ之間的金的微小顆粒。??在溶液中，金納米粒子通過氯金酸（ＨＡｕＣＵ）由還原劑如檸檬酸三鈉、抗壞血酸等還原??成金顆粒，形成由負電荷包裹的穩(wěn)定、均勻、呈單一分散狀態(tài)的金顆粒懸浮液，并在??靜電條件下形成穩(wěn)定的疏水膠體狀態(tài)，故而又稱之為膠體金（ｃｏｌｌｏｉｄａｌｇｏｌｄ）。不同粒徑??的膠體金溶液具有不同的光的散射作用，膠體金溶液會呈現(xiàn)不同的顏色，最小的膠體??金（２？５?ｎｍ）是橙色的
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本文編號：2882055