赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)是由各種曲霉屬和青霉屬等真菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物,廣泛存在于谷物和食品中,對人類和動物都有很大的危害。核酸適配體是通過指數(shù)富集的配體進(jìn)化技術(shù)(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)經(jīng)體外篩選得到的單鏈寡核苷酸(ssDNA或RNA),它們可通過自身形成特定復(fù)雜的空間三維結(jié)構(gòu)以高親和力和特異性結(jié)合靶標(biāo)分子。本研究通過改良的氧化石墨烯(Graphene Oxide,GO)的SELEX篩選方法,獲得OTA的核苷酸適配體,結(jié)合GO淬滅熒光和膠體金分光光度法技術(shù),構(gòu)建了兩種基于適配體識別OTA的快速靈敏的檢測方法。首先,基于GO吸附單鏈寡核苷酸ssDNA的原理,采用免固定化的GO-SELEX方法篩選OTA毒素適配體。經(jīng)過10輪篩選獲得適配體富集文庫,經(jīng)克隆測序后得到23條適配體候選序列,經(jīng)一級、二級結(jié)構(gòu),親和性和特異性分析,得到一條特異識別OTA毒素的最佳適配體Seq.14,其解離常數(shù)為138.9±4.9 nmol/L。其次,基于羧基熒光素(FAM)標(biāo)記的適配體與GO之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù),構(gòu)建了一種熒光傳感器。當(dāng)無OTA存在時,FAM標(biāo)記的適配體被GO吸附并淬滅其熒光信號;當(dāng)有OTA存在時,適配體與OTA結(jié)合,從GO上脫落,引起熒光的重新恢復(fù)。在最優(yōu)條件下,OTA毒素濃度在20～3000nmol/L之間與熒光強(qiáng)度呈線性相關(guān)性(R2=0.995),檢測限為21.8nmol/L,加標(biāo)回收率范圍在96.0～119.7%之間,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.8%。該方法可用于紅酒樣品中OTA毒素的檢測。最后,基于核酸適配體對靶標(biāo)的特異性和膠體金分光光度法的靈敏性,建立了一種簡單快速檢測OTA的方法。利用核酸適配體能夠抑制膠體金在高鹽溶液中的聚集,當(dāng)OTA存在時,其與適配體特異性結(jié)合,使膠體金發(fā)生聚集,膠體金的顏色發(fā)生變化。在最優(yōu)的條件下,吸光度的比值(A656nm/A520nm)與OTA濃度在0～300 ng/mL的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,其線性回歸方程為y=0.001x+0.2264,線性相關(guān)系數(shù)R2為0.9962,加標(biāo)回收率為99.2～103.1%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.4%。該方法穩(wěn)定性和重復(fù)性較好,可作為OTA的快速檢測方法。
【學(xué)位單位】：天津科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：Q503;O657.3
【部分圖文】：

天津科技大學(xué)碩士學(xué)位論文ＯＴＡ的特異性識別能力，雜交鏈反應(yīng)模擬脫氧核酶技術(shù)開發(fā)了一種比色法檢測ＯＴＡ。該方法的線性范圍至?０．０１?ｎｍｏｌ／Ｌ。??的有效性已經(jīng)被廣泛證實(shí)，通過物質(zhì)所具有的的特性質(zhì)進(jìn)行定性定量分析。Ｑｉａｎ等利用ＦＲＥＴ原則，設(shè)過熒光傳感和肉眼觀察雙重模式檢測ＯＴＡ。Ｌｖ等測雙鏈ＤＮＡ這一特定性，建立了一種ＯＴＡ檢測方法。其互補(bǔ)鏈配對形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，通過ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ作為指部分適配體與ＯＴＡ結(jié)合，加入其互補(bǔ)鏈與ＰｉｃｏＧｒｅｅｎＡ的適配體雜交形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ插入到雙號。根據(jù)熒光信號與ＯＴＡ濃度的相關(guān)性，定量檢測Ｏ檢測范圍超過５個數(shù)量級。??

Ａｐｔａｍｅｒ?Ｏｃｈｒａｔｏｘｉｎ?Ａ?Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ?ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ??ｓｔｒａｎｄ??圖１－２無標(biāo)記焚光檢測ＯＴＡ示意圖??Ｆｉｇ．?１－２?Ｌａｂｅｌ－ｆｒｅｅ?ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ?ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ?ＯＴＡ??經(jīng)典的電化學(xué)傳感器是以電極表面作為一個固定化傳感元件的平臺，結(jié)合在其上??面的分析物通過對電流、電位或電阻變化的監(jiān)控來進(jìn)行檢測。Ｌｉｎｇ等Ｈ｜］基于金納米粒??子（ＡｕＮＰｓ）共價結(jié)合石墨烯片的電化學(xué)阻抗用于檢測皮摩爾級ＯＴＡ，原理如圖丨－３：金??納米顆粒共價鍵合還原氧化石墨烯（ＡｕＮＰｓ－ｒＧＯ）在石墨烯片上產(chǎn)生了大量分散良好??的ＡｕＮＰ，其具有巨大的ＤＮＡ結(jié)合位點(diǎn)，因為單個ｒＧＯ片和每個ＡｕＮＰ可以裝載數(shù)??百個ＤＮＡ鏈。制作了一個夾心模型的適體傳感器，其中包含固定在金電極上的硫化??的捕獲ＤＮＡ以捕獲適配體，然后將傳感界面與所需濃度的ＯＴＡ共同孵育，后將??ＡｕＮＰｓ－ｒＧＯ官能化的ＤＮＡ與殘留的適配體雜交。通過信號放大平臺，檢測電荷轉(zhuǎn)移??電阻（Ｒｃｔ）〇該方法檢測限為０．３?ｐｇ／ｍＬ或０．７４?ｐｍｏｌ／Ｌ。Ｈｕａｎｇ等［４２］基于滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)??（ＲＣＡ）來實(shí)現(xiàn)電化學(xué)信號擴(kuò)大進(jìn)而進(jìn)行檢測ＯＴＡ。其原理是：用于ＲＣＡ的引物由兩??部分組成，一部分為ＯＴＡ的核酸適配體，而另一部分與電極表面上的捕獲探針互補(bǔ)。??當(dāng)ＯＴＡ存在時

能夠被ＧＯ保護(hù)抵抗不受核酸酶降解，當(dāng)ｓｓＤＮＡ脫離ＧＯ表面后，由于不再受到??ＧＯ的保護(hù)，能被核酸酶的降解。除此之外，ＧＯ同樣能夠?qū)Γ遥危廉a(chǎn)生保護(hù)能力�；�??于ＧＯ對核酸分子的保護(hù)效果，建立了?ＧＯ穩(wěn)定ＲＮＡ的方法，其原理如圖１－４所示，??并基于該方法發(fā)展了?ＲＮａｓｅ?Ｈ輔助的信號放大方法用于檢測ＤＮＡ，檢測限為０．１??ｐｍｏｌ／Ｌ〇??＊■?ｒ＼１Ｂ?＜３＾?ＩＳｕｒｌｅａｗ，?ｆ?＼／?＼?Ｔａｒｇｅｔ??圖１－４?ＧＯ保護(hù)ＲＮＡ探針的原理??Ｆｉｇ．?１－４?Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ?ｏｆ?ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ＲＮＡ?ｐｒｏｂｅ?ｗｉｔｈ?ＧＯ??１．４．２納米金粒子??納米金（ｇｏｌｄ?ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ，ＡｕＮＰｓ），是一種直徑１￣１００?ｎｍ之間的金的微小顆粒。??在溶液中，金納米粒子通過氯金酸（ＨＡｕＣＵ）由還原劑如檸檬酸三鈉、抗壞血酸等還原??成金顆粒，形成由負(fù)電荷包裹的穩(wěn)定、均勻、呈單一分散狀態(tài)的金顆粒懸浮液，并在??靜電條件下形成穩(wěn)定的疏水膠體狀態(tài)，故而又稱之為膠體金（ｃｏｌｌｏｉｄａｌｇｏｌｄ）。不同粒徑??的膠體金溶液具有不同的光的散射作用，膠體金溶液會呈現(xiàn)不同的顏色，最小的膠體??金（２？５?ｎｍ）是橙色的
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本文編號：2882055