近年來,隨著大眾健康意識的增強,對人體具有重要免疫調(diào)節(jié)作用的益生元產(chǎn)品受到越來越多人的青睞。作為重要的益生元和功能性食品,果寡糖漿具有很多優(yōu)良的特性,如甜度高、吸濕性強、滲透壓強等特點。另外,果寡糖漿不含有葡萄糖和蔗糖,也適用于糖尿病人等特殊人群。因此,果寡糖漿作為一種替代蔗糖的新一代甜味劑,具有非常好的應用前景。但是,現(xiàn)有的果寡糖漿的生產(chǎn)過程中,存在很多問題,比如:利用現(xiàn)有的酶催化產(chǎn)果聚糖的效率不高、果寡糖漿純化除葡萄糖困難,等等。本研究綜合運用新酶基因挖掘和異源表達、酶催化機制研究、分子改造、酶的固定化和偶聯(lián)催化等技術(shù)手段,為解決果寡糖漿制備工藝中的關(guān)鍵技術(shù)難題奠定基礎(chǔ)。首先,本文首次對丙酮丁醇梭菌的菌果聚糖合成酶(levansurase)CA-SacB進行了基因克隆、酶學性質(zhì)分析與分子改造方面的研究。結(jié)果表明,該酶具有催化產(chǎn)物特異性好的特點,催化產(chǎn)物只有高聚合度的果聚糖和單糖,沒有果寡糖的產(chǎn)生。經(jīng)過測定該酶Km和Vmax值分別為64 mmol/L和190 umol/min/mg;對蔗糖底物的轉(zhuǎn)化率高達60%,具有一定的工業(yè)生產(chǎn)應用價值。該酶是目前國內(nèi)外首個從嚴格厭氧菌中克隆得到的菌果聚糖合成酶,與已經(jīng)報道的菌果聚糖合成酶的同源性最高只有53%,對菌果聚糖合成酶的相關(guān)研究具有重要的參考價值。為了深入研究菌果聚糖合成酶的催化機制、蛋白空間結(jié)構(gòu)和進化規(guī)律,挖掘新的菌果聚糖合成酶資源,本研究還通過宏基因組改組的方法對CA-SacB進行了分子改造,為相關(guān)領(lǐng)域的研究提供一個新方法和思路。第二,通過研究菌果聚糖合成酶的條件致死現(xiàn)象和分子定位,為揭示該酶的表達特征、催化機制和分子進化奠定基礎(chǔ)。眾所周知,表達解淀粉芽孢桿菌的菌果聚糖合成酶BA-SacB的大腸桿菌不能在含有蔗糖的培養(yǎng)基上生長,因此BA-SacB常作為一種負篩選標記,在分子生物學研究中被廣泛應用。但是這種條件致死現(xiàn)象的機理一直不清楚。本研究通過對BA-SacB信號肽的刪除和分子定位研究,在國內(nèi)外首次證明了這一條件致死現(xiàn)象與BA-SacB的分泌表達和levan在周質(zhì)空間的形成直接相關(guān)。此外,還通過定點突變和區(qū)段刪除等方法對該酶進行了分子改造,通過分析突變前后的酶學性質(zhì),并結(jié)合生物信息學分析,為揭示該酶的催化機理及分子進化規(guī)律提供理論依據(jù)。第三,本研究對幾種新的菌果聚糖水解酶(levanase)基因進行了克隆、異源表達和酶學特征分析。分別克隆到來源于解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的多個新的菌果聚糖水解酶,并分別對其酶學性質(zhì)分析,催化產(chǎn)物成分分析和生物信息學分析。研究表明,來源于地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的兩種菌果聚糖水解酶BL-LEV和BS-LEV2屬于外切酶,其催化產(chǎn)物中含有大量的果糖,但沒有低聚糖的產(chǎn)生。這兩種酶Km值分別為16 mmol/L和28 mmol/L菌果聚糖,最適反應溫度分別為30℃和20℃,pH分別為8.0和7.0;而來源于解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的另外兩種菌果聚糖水解酶BA-LEV和BS-LEV1則表現(xiàn)為內(nèi)切酶活性,其催化產(chǎn)物中多為分子量在1200 Da的果寡糖,但沒有果糖的產(chǎn)生。經(jīng)過測定這兩種酶Km值分別為69 mmol/L和82 mmol/L,最適反應溫度在30-70℃之間。BA-LEV的pH范圍較廣,從3到7范圍內(nèi)活性都很高;而BS-LEV1的最適pH為5。良好的催化效率和不同的酶學特征決定了這幾種菌果聚糖水解酶具有不同的應用價值。最后,本研究通過菌果聚糖合成酶和菌果聚糖水解酶雙酶偶聯(lián)催化,以蔗糖為底物產(chǎn)生高純度果寡糖漿,從而為降低果寡糖漿生產(chǎn)成本,提高產(chǎn)率奠定堅實基礎(chǔ)。本研究首先采用菌果聚糖合成酶催化蔗糖獲得菌果聚糖、單糖和蔗糖的混合物,然后采用改進的工藝對菌果聚糖進行純化,并采用菌果聚糖水解酶將菌果聚糖水解成果寡糖漿。這種雙酶偶聯(lián)催化法具有工藝簡單,果寡糖漿純度高(產(chǎn)物中果寡糖和菌果聚糖含量接近100%)的特點。更重要的是,可以避免傳統(tǒng)方法分離剔除葡萄糖等副產(chǎn)物所需要的復雜工藝。另外,本研究還建立了新的納米氧化鋅固定化和細胞膜固定化體系,對菌果聚糖合成酶和菌果聚糖水解酶分別進行固定化處理,顯著提升了各項酶學性質(zhì)。在此基礎(chǔ)上,對雙酶偶聯(lián)催化過程中的各種影響因素(包括反應溫度、pH反應時間等)進行了響應面綜合分析,確定其最佳條件為:在底物蔗糖濃度為200 g/L的條件下,確定產(chǎn)菌果聚糖最佳條件為:反應溫度為45℃、反應時間7 h、溶液pH為7.0在這樣的條件下催化產(chǎn)糖率為47.44%。在底物菌果聚糖濃度為105 g/L的條件下,確定產(chǎn)果寡糖漿最佳條件為:反應溫度為42℃、反應時間7 h、溶液pH為7.0。在這樣的條件下催化產(chǎn)糖率為88.28%。這一研究對果寡糖漿生產(chǎn)模式的改進具有重要意義,并且對相關(guān)領(lǐng)域的研究也具有重要的參考價值。
【學位單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：O636.1;Q55
【部分圖文】：

Fig. 2-20 Protein sequence alignment（6）進化樹取來源于不同菌的菌果聚糖合成酶的基因序列建立進化樹，如圖2-21所示，該酶與于Paraburkholderia phymatum的菌果聚糖合成酶親緣關(guān)系較近，與來源于Bacillusbtilis的菌果聚糖合成酶親緣關(guān)系較遠。Fig. 2-21 Phylogenetic tree of CA-SacB
【參考文獻】

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本文編號：2854702