酶是由活細(xì)胞產(chǎn)生的具有催化功能的生物大分子,相比于一般催化劑,酶具有很多優(yōu)點,如高活性、專一性、活性可調(diào)控性等。許多酶的活性中心需要結(jié)合金屬離子才能發(fā)揮其催化活性,常見的金屬離子有Mg2+、Zn2+、Fe2+、Mn2+、Co2+和Ca2+等。含鐵酶是常見的金屬酶,其中包括雙加氧酶(鄰苯二酚氧酶等)、單加氧酶(細(xì)胞色素P450酶、甲烷單加氧酶等)、過氧化物酶、過氧化氫酶、歧化酶等。由于酶的催化反應(yīng)非常迅速,僅僅通過實驗手段弄清催化反應(yīng)中涉及的中間體和過渡態(tài)的結(jié)構(gòu)尤其是電子結(jié)構(gòu)還存在許多困難,對催化反應(yīng)的詳細(xì)機(jī)制缺乏系統(tǒng)理解。隨著理論化學(xué)方法的發(fā)展,計算化學(xué)可以從原子層面對酶的反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行深入研究,其研究結(jié)果可以與實驗工作相互補(bǔ)充和驗證,在酶催化機(jī)理研究方面顯示出越來越大的優(yōu)勢。本論文主要采用分子動力學(xué)模擬及量子力學(xué)與分子力學(xué)相組合的(QM/MM)方法對幾類含鐵酶的催化機(jī)理進(jìn)行了深入的理論研究,通過計算獲得了反應(yīng)過程中涉及的中間體和過渡態(tài)的結(jié)構(gòu),并基于對反應(yīng)勢能面分析確定了催化反應(yīng)的最優(yōu)路徑,在原子水平上闡明了這些酶催化反應(yīng)的特點和立體選擇性、區(qū)域選擇性規(guī)律,對一些重要殘基對酶催化活性的影響給出了理論解釋或預(yù)測,為深入理解這些酶的生物學(xué)功能、實驗研究及酶工程奠定了一定的理論基礎(chǔ)。論文工作主要包括:(1)色氨酸裂解酶(NosL)催化胺脫氫反應(yīng)以及羧基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的QM/MM研究L-色氨酸裂解酶(NosL)屬于S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)依賴酶,它主要催化L-色氨酸轉(zhuǎn)化為3-甲基吲哚酸(MIA)。在2014年報道的晶體結(jié)構(gòu)(PDB編碼:4R34)的基礎(chǔ)上,本文用QM/MM方法對NosL酶的反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行研究,催化反應(yīng)過程包括底物氨基脫氫,C-C鍵斷裂和羧基遷移。計算結(jié)果表明,奪氫反應(yīng)存在區(qū)域選擇性,發(fā)生在底物的氨基氫位置,伴隨的反應(yīng)能壘為12.4 kcal/mol,對接下來反應(yīng)的兩條路徑(path1和path2)進(jìn)行深入研究,Cα-Cβ鍵斷裂和Cα-C鍵斷裂對應(yīng)的能壘分別為7.2 kcal/mol和15.0 kcal/mol,Cα-Cβ鍵更容易斷裂是由底物的氨基自由基的電子空穴離域引起的。通過理論計算,確定了實驗上觀察到的中間體源于Cα-C鍵的斷裂,而且Cα-C鍵的斷裂和羧基自由基的遷移是協(xié)同發(fā)生的,這和實驗上的EPR電子捕獲分析結(jié)果是一致的,并可以解釋實驗中沒有觀測到羧基自由基的現(xiàn)象。副產(chǎn)物(3-甲基吲哚)的生成來自于Cα-Cβ鍵的斷裂,副產(chǎn)物的生成伴隨的能壘為19.5 kcal/mol。然而,主產(chǎn)物3-甲基吲哚酸的生成為決速步,對應(yīng)的能壘為26.9 kcal/mol。我們的計算結(jié)果可以很好地闡述NosL酶的催化機(jī)理,并對以后研究SAM酶家族有重要作用。(2)煙曲霉毒素B內(nèi)過氧化酶(FtmOx1)催化環(huán)氧化反應(yīng)的QM/MM研究FtmOx1是首次報道出可以催化底物煙曲霉毒素B轉(zhuǎn)變成疣孢青霉原的依賴α-酮戊二酸的單核非血紅素含鐵酶。氧氣分子與底物發(fā)生反應(yīng)生成疣孢青霉原,并沒有發(fā)生O-O鍵斷裂,這與目前所知的其他非血紅素含鐵酶是不同的,但是目前具體的機(jī)理還不明確。本文在FtmOx1酶與α-酮戊二酸或與底物共結(jié)晶的晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了酶-α-酮戊二酸-底物的模型,并用QM/MM方法闡明FtmOx1酶的催化機(jī)理。計算結(jié)果表明,五重態(tài)的FeIV=O復(fù)合物是基態(tài)。FeIv=O復(fù)合物首先奪取228號酪氨酸殘基的羥基上的氫,反應(yīng)能壘是9.1 kcal/mol。如果FeIV=O復(fù)合物直接從底物的C21奪取氫,能壘會升高到33.9 kcal/mol。將228號酪氨酸突變成丙氨酸時,能壘會升高到24.0 kcal/mol。接下來的反應(yīng)是,產(chǎn)生的酪氨酸自由基從底物C21上奪取氫(H2),能壘是23.8kcal/mol。第二分子氧氣進(jìn)入活性中心并與底物的C21自由基結(jié)合,完成環(huán)氧化反應(yīng),反應(yīng)能壘是4.8 kcal/mol。本文得到的結(jié)論可以為FtmOx1酶反應(yīng)機(jī)理的研究提供有用的信息,并對進(jìn)一步的實驗研究有引導(dǎo)作用。(3)細(xì)胞色素P450酶CYP162C2(PntM)催化戊丙酯菌素F氧化重排機(jī)理的理論研究CYP162C2(PntM)屬于細(xì)胞色素P450酶,它可以催化類倍半萜烯抗生素異丙酯菌素的生物合成。戊丙酯菌素F氧化重排為異丙酯菌素的反應(yīng)過程包括:戊丙酯菌素F的H-1si轉(zhuǎn)移,2si位甲基轉(zhuǎn)移以及異面H-3re的失去。計算結(jié)果表明,第一步的H-Isi轉(zhuǎn)移是催化反應(yīng)的控速步,能壘為20.3kcal/mol,這與實驗上的關(guān)于反應(yīng)能壘的結(jié)果(18.5～18.7kcal/mol)是一致的。氫轉(zhuǎn)移后,空間位阻阻礙了和血紅素相連的羥基回彈到底物的C1位置,這不同于普通的P450酶。最后一步的異面失氫(H-3re)過程是卟啉環(huán)上的羧基通過水橋完成的。通過對中間體的不同位置選擇性脫氫,可以生成三種異構(gòu)化產(chǎn)物(戊丙酯菌素A,B和P),分別對應(yīng)著三種不同的路徑。為了深入研究PntM酶的催化機(jī)理,我們進(jìn)一步對底物類似物的反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行研究,結(jié)果表明底物類似物對催化反應(yīng)的氧化重排過程影響很小,我們猜測底物類似物可能會對酶的結(jié)合過程產(chǎn)生影響。(4)泛酸依賴單氧酶水楊酸羥化酶的催化機(jī)理的研究水楊酸水解酶(SALH)屬于泛酸依賴的單氧酶,它可以催化水楊酸通過羥基化和脫羧反應(yīng)轉(zhuǎn)化為鄰苯二酚。在晶體結(jié)構(gòu)(PDB編碼:5evy)的基礎(chǔ)上,本文用QM/MM方法對SALH的反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行深入研究。通過理論計算,對之前提出的反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行了修正,整個酶催化反應(yīng)包括兩個關(guān)鍵步驟,FAD的C4a-羥基首先攻擊底物的C1位置,隨后,該中間體發(fā)生脫羧反應(yīng)形成鄰苯二酚,然而在SALH酶之前提出的機(jī)理以及它的類似酶(PHBH和MHBH)中,FAD的C4a-羥基首先進(jìn)攻的是底物的C3位置。去質(zhì)子化的底物是活性形式,可以很容易地轉(zhuǎn)化為鄰苯二酚,然而中性的底物對應(yīng)著很高的反應(yīng)能壘(39.8 kcal/mol),這與實驗上測得反應(yīng)最佳的pH為7.6的實驗結(jié)果是一致的。對于去質(zhì)子化的底物,羥基化和脫羧過程是分步進(jìn)行的,其中脫羧過程的能壘為14.5 kcal/mmol,是催化反應(yīng)的決速步驟。我們用不同的泛函(B3LYP,BP,BVMN,PBE,M06和TPSSH)進(jìn)行反應(yīng)機(jī)理的計算,這些不同泛函的實驗結(jié)果是相似的,這些結(jié)果都表明該催化反應(yīng)是高放熱過程,這與SALH酶的相似酶(PHBH)結(jié)果是一致的。本論文的創(chuàng)新之處:(1)通過對SAM自由基酶NosL的催化機(jī)理的深入研究確定了 Ado自由基奪氫反應(yīng)的區(qū)域選擇性,給出了奪氫后底物L(fēng)-色氨酸發(fā)生裂解及羧基遷移過程的多種可能路徑,從理論上預(yù)測的反應(yīng)的主產(chǎn)物和副產(chǎn)物與實驗觀測結(jié)果相吻合,系統(tǒng)闡明了 NosL酶催化反應(yīng)的機(jī)制。(2)深入研究了依賴α-酮戊二酸的煙曲霉毒素B內(nèi)過氧化酶(FtmOx1)的催化機(jī)理,通過對多種自旋態(tài)的研究確定了反應(yīng)物的初態(tài)及反應(yīng)過程電子結(jié)構(gòu)的演化規(guī)律,闡明了 FtmOx1催化反應(yīng)的機(jī)制,為此類酶的實驗研究提供了重要參考。(3)對細(xì)胞色素P450酶(PntM)進(jìn)行了深入研究,充分考慮了鐵中心自旋態(tài)變化對催化活性的影響,給出了 PntM酶無法進(jìn)行氧回彈反應(yīng)的根本原因,闡明了主要產(chǎn)物及異構(gòu)化副產(chǎn)物生成機(jī)制,計算結(jié)果對戊丙酯菌素的生物合成有一定的指導(dǎo)意義。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：O629.8;O643.31
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 緒論
    1.1 酶的概述
        1.1.1 酶的概念及特點
        1.1.2 酶的催化機(jī)制
        1.1.3 酶促反應(yīng)動力學(xué)
    1.2 酶的應(yīng)用前景
    1.3 本論文的研究目的
    參考文獻(xiàn)
第二章 理論基礎(chǔ)和計算方法
    2.1 量子化學(xué)方法
    2.2 分子動力學(xué)方法
    2.3 量子力學(xué)與分子力學(xué)（QM/MM）組合方法
    參考文獻(xiàn)
第三章 色氨酸裂解酶的理論研究
    3.1 前言
    3.2 計算方法
        3.2.1 計算模型
        3.2.2 QM/MM計算
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 酶-底物復(fù)合物的結(jié)構(gòu)
        3.3.2 反應(yīng)機(jī)理
        3.3.3 殘基靜電分析
    3.4 結(jié)論
    參考文獻(xiàn)
第四章 煙曲霉毒素B內(nèi)過氧化酶的理論研究
    4.1 前言
    4.2 計算方法
        4.2.1 模型構(gòu)建
        4.2.2 QM/MM計算
    4.3 結(jié)果與討論
IV=O復(fù)合物的結(jié)構(gòu)'>        4.3.1 Fe^IV=O復(fù)合物的結(jié)構(gòu)
        4.3.2 反應(yīng)物的自然軌道
        4.3.3 氫抽取反應(yīng)
        4.3.4 底物脫氫和環(huán)氧化
    4.4 結(jié)論
    參考文獻(xiàn)
第五章 細(xì)胞色素P450酶CYP161C2的理論研究
    5.1 前言
    5.2 計算方法
        5.2.1 動力學(xué)模擬
        5.2.2 QM/MM計算
    5.3 結(jié)果與討論
        5.3.1 Cpd I的結(jié)構(gòu)
        5.3.2 反應(yīng)路徑
        5.3.3 底物類似物的結(jié)果
    5.4 結(jié)論
    參考文獻(xiàn)
第六章 水楊酸水解酶的理論研究
    6.1 前言
    6.2 計算方法
        6.2.1 模型
        6.2.2 QM/MM方法
    6.3 結(jié)果和討論
        6.3.1 優(yōu)化的反應(yīng)物
        6.3.2 SALH與中性底物的反應(yīng)機(jī)理
        6.3.3 SALH與去質(zhì)子化底物的反應(yīng)機(jī)理
    6.4 結(jié)論
    參考文獻(xiàn)
碩士期間發(fā)表論文
致謝
附已發(fā)表論文
學(xué)位論文評閱及答辯情況表

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉文劍;;新一代相對論量子化學(xué)方法[J];中國基礎(chǔ)科學(xué);2007年02期

2 陳紅霞;酶工程與抗生素工業(yè)[J];國外醫(yī)藥(抗生素分冊);2005年06期

3 薛璐,馬鶯;透性化海藻糖合酶的研究[J];食品與發(fā)酵工業(yè);2002年01期

本文編號：2854408