肝素是一種由重復(fù)的二糖單元組成的具有多分散性的線性多糖,因其具有和抗凝血酶Ⅲ特異性結(jié)合的序列而具有促進(jìn)抗凝血活性的生物功能,20世紀(jì)30年代開(kāi)始肝素被應(yīng)用于臨床上對(duì)靜脈血栓、肺栓塞和深靜脈栓塞的治療。如今的肝素大部分從豬小腸粘膜中提取,繼2008年的肝素鈉危機(jī)后,出于對(duì)單一的肝素生物來(lái)源安全性的擔(dān)憂,美國(guó)藥典委員會(huì)在2015年召開(kāi)了肝素表征研討會(huì),討論了將牛肝素重新引入肝素市場(chǎng)的可能。因近十年瘋牛病疫情逐漸被控制,美國(guó)食品藥品管理局也成立了牛肝素工作小組,這一舉動(dòng)帶動(dòng)了科研單位對(duì)牛肝素的研究。低分子肝素是由未分級(jí)肝素經(jīng)過(guò)降解后制備得到的一類分子量更小的抗凝血藥物,相比肝素,低分子肝素的抗凝性質(zhì)更可控,半衰期較長(zhǎng),生物有效性更高。根據(jù)降解方法的不同,低分子肝素可以分為以下幾類,化學(xué)β-消除裂解法制備的依諾肝素鈉,化學(xué)脫氨基裂解法制備的達(dá)肝素鈉和那屈肝素鈣,酶解β-消除裂解法制備的汀肝素鈉和自由基氧化裂解法制備的帕肝素鈉。因低分子肝素具有更優(yōu)良的性質(zhì),被用于制備低分子肝素的未分級(jí)肝素占到了其總量的60%,依諾肝素鈉是被應(yīng)用最廣泛的低分子肝素藥物,在美國(guó)市場(chǎng)中可以占到70%的市場(chǎng)份額。世界衛(wèi)生組織通過(guò)建立標(biāo)準(zhǔn)體系規(guī)范并統(tǒng)一了肝素和低分子肝素藥物的活性單位,各國(guó)藥典也根據(jù)世界衛(wèi)生組織的要求在本國(guó)藥典中對(duì)肝素和低分子肝素的活性和結(jié)構(gòu)提出了具體的要求,并相應(yīng)的提供藥物表征的指導(dǎo)方法。在2010年,美國(guó)食品藥品管理局批準(zhǔn)了第一批依諾肝素鈉仿制藥,提出了保證仿制藥和其原研產(chǎn)品等同性的五個(gè)標(biāo)準(zhǔn),即理化性質(zhì)等同,原料和降解工藝等同,二糖組成、糖片段指紋圖譜和寡糖序列等同,生物和生化指標(biāo)等同,藥效學(xué)性質(zhì)等同。同年中國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局藥品審評(píng)中心也對(duì)低分子肝素的分類報(bào)批提出建議,并在2014年發(fā)表文章,提出了低分子肝素類藥物結(jié)構(gòu)確證的研究思路,包括單糖組成、二糖譜、寡糖片段分布和寡糖序列以及末端結(jié)構(gòu)等。此外,不同生物來(lái)源的肝素藥品之間結(jié)構(gòu)和活性具有差異,而低分子肝素來(lái)源于未分級(jí)肝素,其結(jié)構(gòu)與其母本肝素具有很高的相關(guān)性,基于活性五糖序列結(jié)構(gòu)的抗凝活性因此也高度相關(guān),因此對(duì)低分子肝素和其母本肝素之間的構(gòu)效關(guān)系研究對(duì)低分子肝素的質(zhì)量評(píng)估也有重要作用。質(zhì)譜是一種可以和多種分離方法聯(lián)用的分析方法,可以實(shí)現(xiàn)高靈敏度、高分辨率和高特異性,高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用方法已經(jīng)被充分開(kāi)發(fā)出來(lái),用于低分子肝素的結(jié)構(gòu)表征。核磁共振波譜法具有相對(duì)較低的靈敏度,但其分辨率極高,并且可以解析糖苷鍵類型,分辨同分異構(gòu)體,識(shí)別雜質(zhì)組分,因此也被廣泛地用于低分子肝素結(jié)構(gòu)表征。針對(duì)美國(guó)食品藥品管理局和中國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局藥品審評(píng)中心對(duì)低分子肝素結(jié)構(gòu)確證的要求和建議,低分子肝素的結(jié)構(gòu)表征可以大致總結(jié)為兩種策略,即Top-down和Bottom-up。與蛋白質(zhì)組學(xué)分析策略類似,低分子肝素的Top-down分析策略即不對(duì)樣品進(jìn)行前處理,直接進(jìn)行分析的策略,在常規(guī)的低分子肝素結(jié)構(gòu)表征中主要包括以下幾種,使用凝膠排阻色譜測(cè)定低分子肝素相對(duì)分子質(zhì)量及分布,使用液質(zhì)聯(lián)用法分析低分子肝素完整糖鏈指紋圖譜,使用核磁共振波譜法分析低分子肝素的糖醛酸組成和糖胺取代情況,以及使用二級(jí)質(zhì)譜法測(cè)定低分子肝素糖鏈序列。Bottom-up分析策略需要將低分子肝素糖鏈進(jìn)行降解,而后對(duì)其二糖組成或寡糖組成進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征,再進(jìn)一步推測(cè)樣品完整結(jié)構(gòu)信息。主要包括通過(guò)高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、液質(zhì)聯(lián)用法等測(cè)定低分子肝素的完全酶解產(chǎn)物的二糖組成,或通過(guò)上述分析方法分析低分子肝素部分酶解的寡糖組成等。本論文通過(guò)結(jié)合多種目前被廣泛應(yīng)用的Top-down分析方法和Bottom-up分析方法建立了一套全面表征低分子肝素藥物的分析策略,其中Top-down方法包括以親水相互作用色譜-質(zhì)譜聯(lián)用為基礎(chǔ)的完整糖鏈指紋圖譜分析和以核磁共振波譜為基礎(chǔ)的單糖組成分析,Bottom-up方法包括以離子對(duì)反相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用為基礎(chǔ)的二糖分析和以親水相互作用色譜-質(zhì)譜聯(lián)用為基礎(chǔ)的寡糖組分分析。進(jìn)一步應(yīng)用該全面分析策略,進(jìn)行了三個(gè)層次的研究:①比較了市售低分子肝素之間的相似性,并探討低分子肝素結(jié)構(gòu)相似性的標(biāo)準(zhǔn);②探究了以牛小腸肝素和牛肺肝素為母本,應(yīng)用化學(xué)β消除裂解工藝制備的兩種低分子肝素與依諾肝素鈉原研藥之間的構(gòu)效差異,并探討了低分子肝素和母本之間的聯(lián)系;③全面評(píng)估六對(duì)來(lái)源于不同低分子肝素生產(chǎn)企業(yè)的未分級(jí)肝素和以其為母本的低分子肝素的結(jié)構(gòu)關(guān)系,并通過(guò)主成分分析得到母本肝素和低分子肝素之間的聯(lián)系和差異。此外,本論文還開(kāi)發(fā)了一種更有利于低分子肝素質(zhì)譜檢測(cè)的負(fù)離子模式下的毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用方法,并成功地分別應(yīng)用Top-down和Bottom-up分析策略測(cè)定了依諾肝素鈉的完整糖鏈組成和寡糖組成。本論文的主要研究成果如下:1.建立了綜合的Top-down和Bottom-up分析策略我們綜合了 Top-down和Bottom-up的分析策略,應(yīng)用HILIC-MS方法測(cè)定了依諾肝素鈉完整糖鏈的組成和分布,同時(shí)用酶解法處理樣品,通過(guò)RPIP-MS和HILIC-MS分別檢測(cè)了其二糖組成和寡糖組成,并最終用NMR檢測(cè)了不同種類的糖醛酸在低分子肝素中的含量,建立了一套全面的依諾肝素鈉評(píng)估體系。通過(guò)比較4種市售依諾肝素鈉注射液可以發(fā)現(xiàn),來(lái)源于同一個(gè)生產(chǎn)廠家的原研藥Lovenox(?)和Clexane(?)具有很小的批次間差異,由Sandoz和Teva生產(chǎn)的依諾肝素鈉仿制藥與原研藥注射液具有相似的結(jié)構(gòu)特征,在糖鏈的相對(duì)含量上也類似。在Clexane(?)和Lovenox(?)中也可以觀察到大于系統(tǒng)誤差的批次間差異,兩種原研藥之間的差異說(shuō)明,相同的依諾肝素鈉產(chǎn)品的糖鏈組成可以在一定范圍內(nèi)有浮動(dòng)。2.應(yīng)用綜合分析策略比較了兩種牛低分子肝素應(yīng)用綜合分析策略,我們比較了以牛小腸肝素和牛肺肝素為母本,應(yīng)用化學(xué)β-消除裂解工藝制備的兩種低分子肝素與依諾肝素鈉原研藥Lovenox(?)之間的構(gòu)效差異,并探討了低分子肝素和母本之間的聯(lián)系。在結(jié)構(gòu)表征實(shí)驗(yàn)中,兩種牛低分子肝素均被檢測(cè)到和Lovenox(?)具有一定的可比性。在活性測(cè)試中,盡管兩種牛肝素的效能都低于豬小腸肝素,而由這兩種肝素裂解產(chǎn)生的依諾肝素鈉卻與Lovenox(?)具有類似的抗Ⅱa因子和抗Xa因子效價(jià)。因此,雖然牛的未分級(jí)肝素相比豬肝素會(huì)有一些結(jié)構(gòu)和功能上的不同,但這些差異在其降解后的產(chǎn)物——低分子肝素中間會(huì)成為微小差異,因此由�；蛘哓i的未分級(jí)肝素經(jīng)不同的工藝裂解得到的產(chǎn)品可能都會(huì)具有一定的可比性。此外,在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn),在單糖組成和寡糖組成上,低分子肝素傾向于表現(xiàn)出和其母本肝素相似的組成特征。3.應(yīng)用了綜合分析策略得到低分子肝素和其母本肝素的關(guān)聯(lián)性本部分的研究中,除了應(yīng)用Top-down和Bottom-up分析方法全面評(píng)估六對(duì)來(lái)源于不同低分子肝素生產(chǎn)企業(yè)的未分級(jí)肝素和以其為母本的低分子肝素的結(jié)構(gòu)關(guān)系外,我們應(yīng)用了一種新的生物信息學(xué)軟件GlycCompSoft,并重點(diǎn)關(guān)注了如何通過(guò)數(shù)據(jù)分析手段獲得傳統(tǒng)的數(shù)據(jù)呈現(xiàn)方式所不能呈現(xiàn)出來(lái)的差異信息。主成分分析法成功地得到了肝素和以其為母本的低分子肝素之間的結(jié)構(gòu)聯(lián)系,并成功地區(qū)分了不同的生產(chǎn)廠家之間的低分子肝素產(chǎn)品。本研究拓展了主成分分析在藥物評(píng)估領(lǐng)域的應(yīng)用,確認(rèn)了其對(duì)放大相似產(chǎn)品之間的差異具有明顯作用,可以用于匹配未知信息的肝素母本和低分子肝素產(chǎn)品。4.建立了一種負(fù)離子模式下分析低分子肝素的CE-MS方法我們開(kāi)發(fā)了一種新的毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜法對(duì)肝素二糖、磺達(dá)肝癸鈉、低分子肝素酶解產(chǎn)物和低分子肝素完整糖鏈進(jìn)行分析,并得出結(jié)論,通過(guò)在背景電解液種添加甲醇和使用蛋白質(zhì)圖層的鞘流管,可以將毛細(xì)管電泳和質(zhì)譜在負(fù)離子模式下聯(lián)用,進(jìn)而分析肝素及低分子肝素這一類更容易帶負(fù)電荷的酸性分子。通過(guò)本毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜法采集得到的分析結(jié)果與親水相互作用色譜-質(zhì)譜分析的結(jié)果類似,卻擁有更簡(jiǎn)便的實(shí)驗(yàn)操作和更短的分析周期。相比之前發(fā)表的正離子模式毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜法分析肝素寡糖,負(fù)離子模式下的毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜法使得進(jìn)一步的二級(jí)質(zhì)譜測(cè)序低分子肝素成為可能。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：TQ464;O657.63
【部分圖文】：

其關(guān)注了肝素藥品儲(chǔ)備、來(lái)源和污染方面可能存在的風(fēng)險(xiǎn)。ＦＤＡ在２０１６年成立??了牛肝素工作小組，這些舉動(dòng)帶動(dòng)了科研單位對(duì)牛肝素研究的復(fù)蘇［１６，１７］，同時(shí)對(duì)??羊肝素的表征也逐漸展開(kāi)［｜８〗。美國(guó)市場(chǎng)上藥用肝素的發(fā)展歷史如

質(zhì)酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ?ａｃｉｄ，ＨＡ）在生物體內(nèi)共同屬于糖胺聚糖（Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ，??ＧＡＧｓ）家族。肝素的生物合成在肥大細(xì)胞的高爾基體進(jìn)行，包括起始、延伸和??修飾三步，如圖１．３所示。起始步驟即為連接域（Ｌｉｎｋａｇｅ?ｒｅｇｉｏｎ）四糖的合成：??４??

ＧｌｃＮＳ’１］。此外，少數(shù)結(jié)構(gòu)也在研究中被觀察到，例如帶有２－０－Ｓ的ＧｌｃＡ，帶??有?３－（９－Ｓ?的?ＧｌｃＮＡｃ?和游離氧基葡萄糖胺（Ｆｒｅｅ?ａｍｉｎｅ?ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ，Ｇ１ｃＮＨ２）［３２１。??在總結(jié)前人工作的基礎(chǔ)上，今天我們理解的肝素化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖１．４所示。其??相對(duì)分子量在５，０００－４０，０００?Ｄａ之間分布，大多數(shù)組分的分子量在１２，０００－２５，０００??Ｄａ之間，是由重復(fù)的二糖單元組成的線性多糖。肝素二糖單元內(nèi)部ＨｅｘＡ和ＧｌｃＮ??之間由（３－１，４糖苷鍵連接組成，二糖單元之間由ａ－ｌ，４糖苷鍵連接。ＨｅｘＡ主要為??ｐ－Ｄ－ＧｌｃＡ和ａ－Ｌ－ＩｄｏＡ，其中ＩｄｏＡ的Ｃ２可能發(fā)生２－０－Ｓ修飾。ＧｌｃＮ主要為ａ－Ｄ－??ＧｌｃＮＡｃ、ｔｘ－Ｄ－ＧｌｃＮＳ
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 張震;;低分子肝素的結(jié)構(gòu)確證研究[J];中國(guó)新藥雜志;2014年08期

本文編號(hào)：2851017