珍稀藥用真菌靈芝在功能食品和藥品領(lǐng)域應用廣泛,多糖是其最主要的活性成分之一,在抗腫瘤、調(diào)節(jié)機體免疫等方面效果顯著。但由于多糖結(jié)構(gòu)的復雜性以及靈芝原料的多樣性和純化技術(shù)上的差異,導致其分子結(jié)構(gòu)尚未完全探明,更缺乏靈芝多糖的構(gòu)效關(guān)系研究。本論文以赤芝子實體多糖為研究對象,對其進行分離純化并系統(tǒng)表征其結(jié)構(gòu)單元和構(gòu)象特征;結(jié)合體內(nèi)外免疫調(diào)節(jié)活性評價,闡釋其構(gòu)效關(guān)系;在此基礎(chǔ)上開發(fā)針對活性多糖的制備技術(shù)和檢測方法,為此類成分的進一步應用及質(zhì)控奠定基礎(chǔ)。本研究首先比較了中國藥典收錄的靈芝即赤芝和紫芝子實體多糖的分子量分布特征和單糖組成,揭示了赤芝和紫芝在大分子量多糖(M_w1×10~6 g/mol)成分上的差異,并明確了赤芝多糖的分子量分布與其菌株遺傳特性間的非相關(guān)性;不同菌株赤芝子實體粗多糖的單糖組成相似,均主要由氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖及葡萄糖醛酸組成;單糖比例上存在差異,其中葡萄糖占比最高。通過優(yōu)化獲得低濃度乙醇沉淀法純化多糖的工藝,制備得到均一多糖組分GLP20,HPSEC-MALLS-RI分析其重均分子量為2.42×10~6 g/mol,多分散系數(shù)為1.32,苯酚硫酸法測定其糖含量為95.9%。通過單糖組成、甲基化及NMR分析,明確了赤芝大分子多糖組分GLP20的一級結(jié)構(gòu)單元,是以β-1,3-糖苷鍵連接為主鏈、β-1,6-糖苷鍵連接為支鏈的葡聚糖,其支鏈與主鏈的比為1:3。應用激光光散射和HPSEC-MALLS-RI-VS聯(lián)用分析,對該多糖在溶液中的構(gòu)象特征進行了系統(tǒng)表征。證明其在水溶液體系中呈現(xiàn)三股螺旋構(gòu)象,在溫度不超過135℃范圍內(nèi)構(gòu)象穩(wěn)定;該多糖在DMSO和濃度大于0.15 M的NaOH溶液中出現(xiàn)構(gòu)象轉(zhuǎn)變。流變學特性分析顯示,GLP20水溶液呈剪切變稀非牛頓流體,在一定濃度和溫度下可形成弱膠體;GLP20多糖的成膠機理與香菇多糖相似,為高度纏結(jié)的三螺旋鏈形成連續(xù)的網(wǎng)絡從而導致多糖溶液的凝膠化,不存在交聯(lián)點及明顯聚集體,且GLP20凝膠具有熱力學可逆性,這些特性與GLP20的高級構(gòu)象特征相關(guān)。為了闡釋赤芝β-葡聚糖在免疫調(diào)節(jié)功能上的構(gòu)效關(guān)系,本研究通過超聲降解得到結(jié)構(gòu)單元相同但分子量范圍在3.5×10~4-2.42×10~6 g/mol的系列組分,并通過硫酸化修飾得到系列取代度和分子量大小不同的衍生物;系統(tǒng)比較了β-葡聚糖分子量及結(jié)構(gòu)修飾對其增強免疫和抗炎活性的影響。體內(nèi)外活性比較結(jié)果顯示,分子量大于1.80×10~6 g/mol的兩個多糖組分表現(xiàn)出較好的提高免疫活性,分子量為3.5×10~4 g/mol的低分子量組分表現(xiàn)出更好的抗炎功效。硫酸化修飾可以改變赤芝β-葡聚糖的分子量和構(gòu)象特征,并可以增強其抗炎活性�？寡谆钚耘c硫酸基取代度和衍生物的分子量相關(guān),取代度較高的組分抗炎活性較好;在取代度相近時,重均分子量較大的組分活性較好。為給高純度靈芝活性多糖的生產(chǎn)提供方法學依據(jù),本研究基于GLP20的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象特征,建立了赤芝大分子β-葡聚糖的HPSEC-MALLS-RI聯(lián)用檢測分析方法,用于赤芝子實體原料的優(yōu)選和質(zhì)控,并獲得富含此多糖的優(yōu)質(zhì)子實體原料,其大分子量活性多糖含量達到8.2 mg/g,遠高于其他赤芝菌株子實體。通過比較酶法試劑盒檢測法和苯胺藍熒光檢測法對不同結(jié)構(gòu)多糖中β-葡聚糖含量的測定效果,明確了苯胺藍熒光法檢測β-1,3-葡聚糖專一性好。為提高β-葡聚糖的提取效率,本研究比較了不同溶劑對赤芝β-葡聚糖的提取得率,結(jié)果顯示KOH堿溶液提取得率較高,說明赤芝β-葡聚糖主要存在于細胞壁上。通過超微粉碎預處理結(jié)合水提低濃度醇沉,大大提高了赤芝β-葡聚糖的提取得率和純度,可用于赤芝β-葡聚糖的高效制備。
【學位單位】：江南大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：O629.1
【部分圖文】：

靈芝多糖還有多種功效，如通過顯著降低自由基或平等來發(fā)揮抗氧化作用[83]；通過拮抗自由基引起的損傷、抑制脂制谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活力等來發(fā)揮保護肝臟的作用[11]。此外，靈芝多解疲勞等方面，也有很好的效果[11]。說，靈芝多糖因其結(jié)構(gòu)的復雜性，使其藥理活性廣泛，具有重要，在各領(lǐng)域活性作用機制的探索也成為研究熱點。的構(gòu)象研究方法物大分子，多糖的結(jié)構(gòu)非常復雜，可以分成四個層次[84]，即一級構(gòu)（鏈之間以氫鍵的結(jié)合而形成的聚合體）、三級結(jié)構(gòu)（空間呈構(gòu)（鏈之間以非共價鍵的結(jié)合而形成的聚集體）。多糖的初級結(jié)構(gòu)象，對其生物活性有重要影響。對靈芝多糖而言，一級結(jié)構(gòu)報究相對較少。糖在單糖組成、連接基團及連接方式上的差異，使得其分子在溶。多糖在不同溶劑體系中存在的可能的構(gòu)象如圖 2 所示[85]，主要旋狀鏈（單股、雙股、三股）、蠕蟲狀、棒狀和聚合體等等。

圖 2-2 多糖分離純化流程圖 Protocol for the separation and purification of polysaccharide 比較細胞釋放 NO 的模型，用于比較不同品種赤芝子實9]的方法，將樣品配制成系列濃度備用；培養(yǎng) RAW2胰酶消化后，180 ×g 離心 3 min 收集細胞，按照 細胞共培養(yǎng) 48 h。然后取上清，利用 Griess 試劑法PBS 和細菌脂多糖（LPS，1 μg/mL）分別做陰性對照分子量和純度測定后的乙醇濃度對赤芝提取物進行沉淀，并經(jīng)過 2 次編號為 GLP20。以硫酸-苯酚法測定赤芝多糖的糖含S-RI 系統(tǒng)鑒定赤芝多糖的純度，并分析計算其分子LLS-RI 系統(tǒng)定量分析赤芝大分子量活性多糖含量繪制GLP20）作為標準品并配制成0.25 mg/mL、0.5 mg/m

21C 分析幾種主要靈芝子實體中多糖分子量分布。GL(WF)：龍芝 2 號靈芝 1 號；GS：紫芝EC profiles of polysaccharides from the fruiting bodies of Ganoderma spidum Longzhi No. 2‖; GL(HN): G. lucidum Hunong No. 1‖; GS: G. siALLS-RI 分析結(jié)果顯示，赤芝和紫芝的多糖分子量分布特 2 號和滬農(nóng)靈芝 1 號的子實體多糖分布特征相似，均含有 只含有兩個峰，出峰時間最早的峰1在紫芝子實體中沒有檢明顯的示差信號，又有明顯的紫外檢測信號，所以認為此部經(jīng)檢測，峰 3 為分子量為 1×104-1×105g/mol 范圍內(nèi)的混合分子量進行計算，結(jié)果如表 2-2 所示。

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本文編號：2834152