珍稀藥用真菌靈芝在功能食品和藥品領(lǐng)域應(yīng)用廣泛,多糖是其最主要的活性成分之一,在抗腫瘤、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等方面效果顯著。但由于多糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性以及靈芝原料的多樣性和純化技術(shù)上的差異,導(dǎo)致其分子結(jié)構(gòu)尚未完全探明,更缺乏靈芝多糖的構(gòu)效關(guān)系研究。本論文以赤芝子實(shí)體多糖為研究對(duì)象,對(duì)其進(jìn)行分離純化并系統(tǒng)表征其結(jié)構(gòu)單元和構(gòu)象特征;結(jié)合體內(nèi)外免疫調(diào)節(jié)活性評(píng)價(jià),闡釋其構(gòu)效關(guān)系;在此基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)針對(duì)活性多糖的制備技術(shù)和檢測(cè)方法,為此類成分的進(jìn)一步應(yīng)用及質(zhì)控奠定基礎(chǔ)。本研究首先比較了中國(guó)藥典收錄的靈芝即赤芝和紫芝子實(shí)體多糖的分子量分布特征和單糖組成,揭示了赤芝和紫芝在大分子量多糖(M_w1×10~6 g/mol)成分上的差異,并明確了赤芝多糖的分子量分布與其菌株遺傳特性間的非相關(guān)性;不同菌株赤芝子實(shí)體粗多糖的單糖組成相似,均主要由氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖及葡萄糖醛酸組成;單糖比例上存在差異,其中葡萄糖占比最高。通過(guò)優(yōu)化獲得低濃度乙醇沉淀法純化多糖的工藝,制備得到均一多糖組分GLP20,HPSEC-MALLS-RI分析其重均分子量為2.42×10~6 g/mol,多分散系數(shù)為1.32,苯酚硫酸法測(cè)定其糖含量為95.9%。通過(guò)單糖組成、甲基化及NMR分析,明確了赤芝大分子多糖組分GLP20的一級(jí)結(jié)構(gòu)單元,是以β-1,3-糖苷鍵連接為主鏈、β-1,6-糖苷鍵連接為支鏈的葡聚糖,其支鏈與主鏈的比為1:3。應(yīng)用激光光散射和HPSEC-MALLS-RI-VS聯(lián)用分析,對(duì)該多糖在溶液中的構(gòu)象特征進(jìn)行了系統(tǒng)表征。證明其在水溶液體系中呈現(xiàn)三股螺旋構(gòu)象,在溫度不超過(guò)135℃范圍內(nèi)構(gòu)象穩(wěn)定;該多糖在DMSO和濃度大于0.15 M的NaOH溶液中出現(xiàn)構(gòu)象轉(zhuǎn)變。流變學(xué)特性分析顯示,GLP20水溶液呈剪切變稀非牛頓流體,在一定濃度和溫度下可形成弱膠體;GLP20多糖的成膠機(jī)理與香菇多糖相似,為高度纏結(jié)的三螺旋鏈形成連續(xù)的網(wǎng)絡(luò)從而導(dǎo)致多糖溶液的凝膠化,不存在交聯(lián)點(diǎn)及明顯聚集體,且GLP20凝膠具有熱力學(xué)可逆性,這些特性與GLP20的高級(jí)構(gòu)象特征相關(guān)。為了闡釋赤芝β-葡聚糖在免疫調(diào)節(jié)功能上的構(gòu)效關(guān)系,本研究通過(guò)超聲降解得到結(jié)構(gòu)單元相同但分子量范圍在3.5×10~4-2.42×10~6 g/mol的系列組分,并通過(guò)硫酸化修飾得到系列取代度和分子量大小不同的衍生物;系統(tǒng)比較了β-葡聚糖分子量及結(jié)構(gòu)修飾對(duì)其增強(qiáng)免疫和抗炎活性的影響。體內(nèi)外活性比較結(jié)果顯示,分子量大于1.80×10~6 g/mol的兩個(gè)多糖組分表現(xiàn)出較好的提高免疫活性,分子量為3.5×10~4 g/mol的低分子量組分表現(xiàn)出更好的抗炎功效。硫酸化修飾可以改變赤芝β-葡聚糖的分子量和構(gòu)象特征,并可以增強(qiáng)其抗炎活性�？寡谆钚耘c硫酸基取代度和衍生物的分子量相關(guān),取代度較高的組分抗炎活性較好;在取代度相近時(shí),重均分子量較大的組分活性較好。為給高純度靈芝活性多糖的生產(chǎn)提供方法學(xué)依據(jù),本研究基于GLP20的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象特征,建立了赤芝大分子β-葡聚糖的HPSEC-MALLS-RI聯(lián)用檢測(cè)分析方法,用于赤芝子實(shí)體原料的優(yōu)選和質(zhì)控,并獲得富含此多糖的優(yōu)質(zhì)子實(shí)體原料,其大分子量活性多糖含量達(dá)到8.2 mg/g,遠(yuǎn)高于其他赤芝菌株子實(shí)體。通過(guò)比較酶法試劑盒檢測(cè)法和苯胺藍(lán)熒光檢測(cè)法對(duì)不同結(jié)構(gòu)多糖中β-葡聚糖含量的測(cè)定效果,明確了苯胺藍(lán)熒光法檢測(cè)β-1,3-葡聚糖專一性好。為提高β-葡聚糖的提取效率,本研究比較了不同溶劑對(duì)赤芝β-葡聚糖的提取得率,結(jié)果顯示KOH堿溶液提取得率較高,說(shuō)明赤芝β-葡聚糖主要存在于細(xì)胞壁上。通過(guò)超微粉碎預(yù)處理結(jié)合水提低濃度醇沉,大大提高了赤芝β-葡聚糖的提取得率和純度,可用于赤芝β-葡聚糖的高效制備。
【學(xué)位單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：O629.1
【部分圖文】：

靈芝多糖還有多種功效，如通過(guò)顯著降低自由基或平等來(lái)發(fā)揮抗氧化作用[83]；通過(guò)拮抗自由基引起的損傷、抑制脂制谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活力等來(lái)發(fā)揮保護(hù)肝臟的作用[11]。此外，靈芝多解疲勞等方面，也有很好的效果[11]。說(shuō)，靈芝多糖因其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，使其藥理活性廣泛，具有重要，在各領(lǐng)域活性作用機(jī)制的探索也成為研究熱點(diǎn)。的構(gòu)象研究方法物大分子，多糖的結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，可以分成四個(gè)層次[84]，即一級(jí)構(gòu)（鏈之間以氫鍵的結(jié)合而形成的聚合體）、三級(jí)結(jié)構(gòu)（空間呈構(gòu)（鏈之間以非共價(jià)鍵的結(jié)合而形成的聚集體）。多糖的初級(jí)結(jié)構(gòu)象，對(duì)其生物活性有重要影響。對(duì)靈芝多糖而言，一級(jí)結(jié)構(gòu)報(bào)究相對(duì)較少。糖在單糖組成、連接基團(tuán)及連接方式上的差異，使得其分子在溶。多糖在不同溶劑體系中存在的可能的構(gòu)象如圖 2 所示[85]，主要旋狀鏈（單股、雙股、三股）、蠕蟲(chóng)狀、棒狀和聚合體等等。

圖 2-2 多糖分離純化流程圖 Protocol for the separation and purification of polysaccharide 比較細(xì)胞釋放 NO 的模型，用于比較不同品種赤芝子實(shí)9]的方法，將樣品配制成系列濃度備用；培養(yǎng) RAW2胰酶消化后，180 ×g 離心 3 min 收集細(xì)胞，按照 細(xì)胞共培養(yǎng) 48 h。然后取上清，利用 Griess 試劑法PBS 和細(xì)菌脂多糖（LPS，1 μg/mL）分別做陰性對(duì)照分子量和純度測(cè)定后的乙醇濃度對(duì)赤芝提取物進(jìn)行沉淀，并經(jīng)過(guò) 2 次編號(hào)為 GLP20。以硫酸-苯酚法測(cè)定赤芝多糖的糖含S-RI 系統(tǒng)鑒定赤芝多糖的純度，并分析計(jì)算其分子LLS-RI 系統(tǒng)定量分析赤芝大分子量活性多糖含量繪制GLP20）作為標(biāo)準(zhǔn)品并配制成0.25 mg/mL、0.5 mg/m

21C 分析幾種主要靈芝子實(shí)體中多糖分子量分布。GL(WF)：龍芝 2 號(hào)靈芝 1 號(hào)；GS：紫芝EC profiles of polysaccharides from the fruiting bodies of Ganoderma spidum Longzhi No. 2‖; GL(HN): G. lucidum Hunong No. 1‖; GS: G. siALLS-RI 分析結(jié)果顯示，赤芝和紫芝的多糖分子量分布特 2 號(hào)和滬農(nóng)靈芝 1 號(hào)的子實(shí)體多糖分布特征相似，均含有 只含有兩個(gè)峰，出峰時(shí)間最早的峰1在紫芝子實(shí)體中沒(méi)有檢明顯的示差信號(hào)，又有明顯的紫外檢測(cè)信號(hào)，所以認(rèn)為此部經(jīng)檢測(cè)，峰 3 為分子量為 1×104-1×105g/mol 范圍內(nèi)的混合分子量進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果如表 2-2 所示。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2834152