近年來,研究人員投入了大量的精力致力于構(gòu)建高效的生物傳感器以實(shí)現(xiàn)對多種腫瘤標(biāo)志物的靈敏檢測,設(shè)計(jì)了諸如結(jié)合表面增強(qiáng)拉曼光譜、電化學(xué)發(fā)光、熒光、電化學(xué)和光電化學(xué)等技術(shù)的生物傳感器。其中,基于量子點(diǎn)的電化學(xué)發(fā)光生物傳感分析因其靈敏度高、線性范圍寬、背景信號(hào)低等優(yōu)勢引起了越來越多的研究興趣。本文主要探究了基于量子點(diǎn)探針以及各種酶輔助的循環(huán)放大技術(shù)的電化學(xué)發(fā)光生物傳感方法,實(shí)現(xiàn)了對miRNA,CEA以及ATP的高靈敏檢測。本文主要從以下幾個(gè)方面進(jìn)行了研究:1.本工作設(shè)計(jì)了一種基于目標(biāo)引發(fā)酶輔助循環(huán)放大反應(yīng)和DNA walker技術(shù)的電致化學(xué)發(fā)光傳感器,實(shí)現(xiàn)了對目標(biāo)miRNA的高靈敏檢測。當(dāng)目標(biāo)miRNA-21存在時(shí),形成三叉DNA結(jié)構(gòu)并引發(fā)酶輔助的多重循環(huán)放大反應(yīng),最終生成大量的trigger。由于trigger DNA與電極表面的blocking DNA雜交結(jié)合,釋放出來DNA walker,并與電極上的量子點(diǎn)探針雜交結(jié)合,生成Nt.BbvCI的特異性識(shí)別剪切點(diǎn)。該過程中,剪切酶為DNA walker在電極上特定路徑的運(yùn)動(dòng)提供了源源不斷的動(dòng)力。因此,一個(gè)DNA walker能自動(dòng)剪切電極表面的多個(gè)量子點(diǎn)探針,引起放大的ECL信號(hào)變化。在10 fM到100 n M范圍內(nèi),ECL信號(hào)變化值與miRNA-21濃度的對數(shù)具有較好的線性關(guān)系,檢測限為1.5 fM。2.設(shè)計(jì)了一種基于酶循環(huán)放大技術(shù)和脫氧核酶驅(qū)動(dòng)的DNA walker的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器,實(shí)現(xiàn)了對CEA的高靈敏檢測。當(dāng)目標(biāo)CEA與適體結(jié)合后,在引物、模板用下形成三叉DNA結(jié)構(gòu),在酶的輔助作用下進(jìn)行聚合剪切、循環(huán)放大反應(yīng),產(chǎn)生大量的Walker產(chǎn)物鏈,其中包含DNAzyme的特定序列。當(dāng)DNA walker與電極表面的CdSe量子點(diǎn)信號(hào)探針雜交,利用Pb~(2+)離子輔助DNAzyme為動(dòng)力,循環(huán)剪切DNA信號(hào)探針,引起量子點(diǎn)ECL信號(hào)的明顯降低。在檢測物濃度為1.0 fg/m L到100 ng/m L范圍內(nèi),檢測信號(hào)ECL的變化值與CEA的濃度的對數(shù)呈線性關(guān)系,檢測限為0.21 fg/mL。3.設(shè)計(jì)了一種基于銀納米簇雙重猝滅效應(yīng)和多重循環(huán)放大技術(shù)的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器,實(shí)現(xiàn)了對ATP的超靈敏檢測。當(dāng)目標(biāo)ATP與其適體結(jié)合后打開頸環(huán),暴露的序列可以與模板DNA結(jié)合,在聚合酶和剪切酶的作用下實(shí)現(xiàn)多重循環(huán)放大反應(yīng),生成大量DNA產(chǎn)物鏈。同時(shí),通過DNA模板原位合成了Ag NCs。通過循環(huán)產(chǎn)物DNA鏈將含有Ag NCs的DNA接到電極上,由于電極上CdS量子點(diǎn)與Ag NCs與之間的ECL能量轉(zhuǎn)移以及Ag NCs對電極表面附近的共反應(yīng)劑的消耗,實(shí)現(xiàn)了對電極上ECL信號(hào)的雙重猝滅,在1.0 aM到1.0 pM的濃度變化范圍之內(nèi)ECL信號(hào)變化值與檢測物濃度的對數(shù)值呈良好的線性關(guān)系,檢測限為0.27 aM。
【學(xué)位單位】：青島科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：O657
【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 前言
    1.1 電致化學(xué)發(fā)光(Electrochemiluminescence,ECL)
        1.1.1 ECL發(fā)光原理
    1.2 常見的ECL發(fā)光中使用的量子點(diǎn)
        1.2.1 硫族化物量子點(diǎn)
        1.2.2 硅量子點(diǎn)
        1.2.3 碳材料的量子點(diǎn)
        1.2.4 摻雜量子點(diǎn)
    1.3 DNA行走裝置
        1.3.1 單足行走裝置
        1.3.2 雙足行走裝置
        1.3.3 多足行走裝置
        1.3.4 其他新型的行走裝置
    1.4 基于脫氧核酶(DNAzymes)的生物傳感器和納米裝置
        1.4.1 脫氧核酶(DNAzymes)
        1.4.2 基于DNAzymes的生物傳感器
            1.4.2.1 利用DNAzymes作為識(shí)別器件的生物傳感器
            1.4.2.2 DNAzymes作為催化信號(hào)放大器來構(gòu)建生物傳感器
    1.5 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)
        1.5.1 指數(shù)鏈置換放大(E-SDA)
            1.5.1.1 指數(shù)滾環(huán)放大(ERCA)
            1.5.1.2 指數(shù)放大反應(yīng)(EXPAR)
        1.5.2 線性放大
            1.5.2.1 線性SDA
            1.5.2.2 線性RCA
            1.5.2.3 信號(hào)放大策略
第二章 基于多重酶循環(huán)信號(hào)放大和WalkerDNA技術(shù)電化學(xué)發(fā)光檢測miRNA的研究
    2.1 前言
    2.2 實(shí)驗(yàn)部分
        2.2.1 試劑和材料
        2.2.2 實(shí)驗(yàn)裝置
        2.2.3 納米金的制備
        2.2.4 巰基丙酸(MPA)修飾的CdSe量子點(diǎn)的制備
        2.2.5 DNA的預(yù)處理
        2.2.6 傳感器的構(gòu)建
        2.2.7 生物傳感器的ECL檢測
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 材料表征圖
        2.3.2 基于多重酶循環(huán)信號(hào)放大和WalkerDNA技術(shù)電化學(xué)發(fā)光生物傳感器檢測miRNA的原理
        2.3.3 CdSeQDs的電致化學(xué)發(fā)光性能的表征
        2.3.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳分析
        2.3.5 傳感器構(gòu)建過程的表征
        2.3.6 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化
        2.3.7 基于酶輔助的循環(huán)放大和WalkerDNA的電致化學(xué)發(fā)光傳感分析檢測miRNAs研究
        2.3.8 基于酶輔助的循環(huán)放大和WalkerDNA的電致化學(xué)發(fā)光傳感器的選擇性研究
    2.4 本章小結(jié)
第三章 基于脫氧核酶驅(qū)動(dòng)的WalkerDNA和酶循環(huán)放大技術(shù)的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器檢測CEA的研究
    3.1 前言
    3.2 實(shí)驗(yàn)部分
        3.2.1 試劑
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)裝置
        3.2.3 納米金的制備
        3.2.4 CdSeQDs的制備
        3.2.5 試樣及核酸的預(yù)處理
        3.2.6 傳感器的組裝
        3.2.7 電致化學(xué)發(fā)光信號(hào)的檢測
        3.2.8 循環(huán)伏安法檢測
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 材料的表征
        3.3.2 基于WalkerDNA和酶循環(huán)放大技術(shù)電化學(xué)發(fā)光檢測CEA的原理
        3.3.3 電泳表征
        3.3.4 CdSeQDs的電化學(xué)發(fā)光性能
        3.3.5 基于酶驅(qū)動(dòng)的walkerDNA和酶循環(huán)放大的ECL檢測CEA的可行性研究
        3.3.6 電極的組裝表征
        3.3.7 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化
        3.3.8 基于目標(biāo)觸發(fā)酶輔助的循環(huán)放大技術(shù)和鉛離子輔助的WalkerDNA技術(shù)的ECL傳感對CEA的檢測
        3.3.9 基于該ECL方法對CEA的選擇性研究
    3.4 本章小結(jié)
第四章 基于銀納米簇雙重猝滅效應(yīng)和多重循環(huán)放大技術(shù)的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器超靈敏檢測ATP的研究
    4.1 前言
    4.2 實(shí)驗(yàn)部分
        4.2.1 試劑
        4.2.2 實(shí)驗(yàn)裝置
        4.2.3 CdS量子點(diǎn)的制備
        4.2.4 寡核苷酸的預(yù)處理
        4.2.5 目標(biāo)引發(fā)酶輔助循環(huán)放大反應(yīng)
        4.2.6 銀納米簇的制備
        4.2.7 傳感器的制備
        4.2.8 ECL信號(hào)的檢測
        4.2.9 電化學(xué)信號(hào)檢測
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 材料的表征
        4.3.2 實(shí)驗(yàn)原理
        4.3.3 電泳圖
        4.3.4 材料的電化學(xué)發(fā)光性能
        4.3.5 ECL檢測的可行性
        4.3.6 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化
        4.3.7 不同濃度目標(biāo)物的檢測
        4.3.8 傳感器的選擇性研究
        4.3.9 與其他檢測ATP方法的比較
    4.4 本章小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄

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