松脂醇[(+)-pinoresinol](Pin)及其糖苷類化合物—松脂醇單葡萄糖苷[(+)-pinoresinol-4-O-β-Dglucopyranoside](POG)和松脂醇二葡萄糖苷[(+)-1-pinoresinol4,4′-di-O-β-D-glucopyranoside](PDG),均屬雙環(huán)氧木脂素類,具有抑菌、抗癌、降血糖等多種功能活性,但天然含量極低。微生物合成法生產(chǎn)這些物質(zhì)具有時間短、效率高、不受季節(jié)限制等優(yōu)點,但關(guān)于微生物中Pin及其糖苷化合物代謝途徑的關(guān)鍵步驟,特別是催化Pin糖基化的關(guān)鍵酶類卻少見報道。論文以一株能夠合成PDG的杜仲內(nèi)生菌——擬莖點霉XP-8為材料,通過基因組和轉(zhuǎn)錄組分析,在基因水平上解析Pin及其糖苷化合物的代謝途徑;并綜合關(guān)鍵酶抑制劑、前體喂養(yǎng)、關(guān)鍵酶分離純化與催化特性分析等方法與步驟,在物質(zhì)轉(zhuǎn)化和蛋白質(zhì)水平上驗證所得代謝途徑;最后,以糖基化關(guān)鍵步驟為切入點,通過基因特征分析、酶的分離純化與酶學特性研究,獲得與Pin糖苷化合物代謝相關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶與糖苷酶的編碼基因,確定相關(guān)合成途徑及關(guān)鍵基因。所得主要結(jié)果如下:(1)基因組分析揭示擬莖點霉XP-8的代謝途徑多樣性。通過全基因組測序、組裝和注釋,獲得基因組大小為55.2 Mb,GC含量為53.5%,基因組重復序列占0.83%,含17,094個蛋白編碼基因和310個非編碼基因,其中,16,025個蛋白編碼基因在不同數(shù)據(jù)庫中得到功能注釋,占總注釋蛋白質(zhì)編碼基因的93.75%。OrthoMCL分析得到11,818個基因家族,其中64個為特有基因家族,1,140個為特有基因,其中163個為特異基因家族基因。通過antiSMASH預測到80個次級代謝合成基因簇;CAZy數(shù)據(jù)庫分析得到大量碳水化合物代謝可能參與Pin及其糖苷化合物合成的相關(guān)酶類。(2)轉(zhuǎn)錄組分析揭示Pin及其糖苷化合物的合成途徑。菌體樣本通過測序分析,用從頭組裝和參考基因組兩種方法分析其轉(zhuǎn)錄組。得到4.10 Gb的Clean Data,Q30堿基百分比不小于85.02%,與參考基因組的序列比對效率為88.64%,發(fā)掘302個新基因。通過與Nr、GO、COG、KEGG等數(shù)據(jù)庫比對,用無參和有參方法進行基因注釋,發(fā)現(xiàn)有參拼接能夠獲得更多注釋信息,結(jié)果優(yōu)于無參拼接。有參分析中共有2,921條基因被注釋到117個代謝途徑中。共有180條基因,涉及40個酶參與Pin生物合成,涉及糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑、苯丙氨酸生物合成途徑以及苯丙烷途徑等代謝途徑。并篩選出可能參與Pin糖苷化合物合成的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因。(3)酶抑制劑和前體添加法確定Pin和PDG合成途徑。莽草酸途徑抑制劑三甲胺和EDTA能夠強烈抑制Pin與PDG合成;聚酮途徑抑制劑淺藍菌素和碘乙酰胺則對這些物質(zhì)合成沒有影響;莽草酸途徑和苯丙烷途徑的前體和中間代謝產(chǎn)物均能顯著促進Pin與PDG合成。說明,Pin和PDG合成途徑涉及莽草酸途徑和苯丙烷途徑,但不涉及聚酮途徑。(4)催化Pin糖基化反應的糖基轉(zhuǎn)移酶的分析。依次通過70%飽和硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose FF離子交換色譜、Sephadex G-100凝膠過濾和SDS-PAGE電泳對菌體的胞內(nèi)酶進行分離純化,獲得電泳純酶蛋白,其表觀分子量約為49.50 kDa;液相與質(zhì)譜檢測證明,該酶能以Pin和UDP-葡萄糖為底物催化合成POG,但不能催化合成PDG。參考基因組注釋結(jié)果,成功克隆到三個糖基轉(zhuǎn)移酶基因,生物信息學分析表明其均屬GTB超家族,在其N端和C端均有典型的Rossmann折疊,含較多α-螺旋,約占整個分子的46~49%;氨基酸序列同源性分析表明,GT-1和GT-2與其它物種同源性較低,而GT-4與其他物種的同源性可達75%以上。用pET28as和E.coli BL21(DE3)體系對GT-4基因進行原核表達,獲得分子量50 kDa左右的表達產(chǎn)物,并具有催化Pin糖基化反應活性。(5)催化Pin糖苷化合物的β-葡萄糖苷酶的分析。依次用70%飽和硫酸銨沉淀、Hitrap~(Tm) Butyl FF疏水層析、Superdex~(Tm) G200凝膠過濾層析對菌體的胞內(nèi)粗酶液進行分離純化,得到電泳純酶蛋白,其表觀分子量約93.40 kDa,MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定為β-D-葡萄糖苷酶,在擬莖點霉XP-8基因組中的基因序列為Gglean007197.1,為基因水平上相關(guān)研究和基因調(diào)控奠定重要基礎。純化后的酶比活力達75.86 U/mg,純化倍數(shù)30.71,回收率17.04%;酶的最適反應溫度70°C,在30-70°C范圍內(nèi)熱穩(wěn)定性較好,為一種耐熱性葡萄糖苷酶;最適反應pH值5.0,在p H 3.0-7.0范圍內(nèi)有較高酶活性;K~+、Cu~(2+)、Li~+對其催化活性有顯著抑制作用,而Na~+、Mg~(2+)對其則有激活作用,Mn~(2+)、Zn~(2+)、Fe~(2+)的抑制作用不明顯;在底物特異性方面,該酶對β-1,4-糖苷鍵和α-1,2-糖苷鍵有水解活性,對α-1,4和α-1,1糖苷鍵沒有活性,對pNPG和纖維二糖的催化活性最高,其次為β-1,4-糖苷鍵連接的芳香基化合物。更為重要的是,該酶能夠催化POG和PDG的脫糖基反應,說明其與菌株合成Pin糖苷化合物的逆反應有關(guān)。
【學位單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：Q78;O629
【部分圖文】：

圖 1-4 三種木脂素類化合物基本的母核結(jié)構(gòu)（王丹等 2017）Fig.1-4 Nuclear parent structure of three kinds of lignans合成木脂素的單體主要有四種（如圖 1-3）。根據(jù)分子中苯丙素結(jié)構(gòu)單元的聚合方式，可將木脂素類化合物分為木脂素（1ignan）Ⅰ、新木脂素（neolignan）Ⅱ和氧新木脂素（oxyneolignan）III（圖 1-4）。苯丙素單體的第 1 個 C6-C3單元的 9 個碳原子分別編號為 1～9，第 2 個 C6-C3單元的碳原子編號為 1'～9'。兩個單元分子通過側(cè)鏈的 β 碳原子縮合形成的聚合體稱為木脂素（1ignan）Ⅰ。最早木脂素是指 8-8'連接的二聚體。后來發(fā)現(xiàn)在 7-7'、9-9'、7-9'等位置也可以形成四氫呋喃環(huán)氧結(jié)構(gòu)以及在 9-9'形成內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)的木脂素，從而形成了不同結(jié)構(gòu)類型的木脂素化合物，如二芐基丁內(nèi)酯類（dibenzyltyrolactones）、二芐基丁烷類（dibenzyllbutanes）、四氫呋喃類（tetrahydroforans）、聯(lián)苯環(huán)辛烯類（dibenzocycoloctenes）等。通過 β 碳原子以外連接而形成的聚合體統(tǒng)稱為新木脂素（neolignan）Ⅱ。之后又把 C6-C3 單元分子之間通過氧原子連接的一些化合物稱之為氧新木脂素（oxyneolignan）III。木脂素類化合物的結(jié)構(gòu)復雜，并且具有不同類型的取代基和立體異構(gòu)體；其生物活性多樣化，有抗癌、抗氧化、抗病毒等活性；另外，還可以用作生長抑制劑、植物萌發(fā)抑制劑和一些殺菌劑和殺蟲劑。

圖 1-3 木脂素單體Fig.1-3 Monomerof lignans（1）桂皮酸 cinnamic acid（2）桂皮醇 cinnamyl alcoh（3）丙烯苯 propenyl benzene （4）稀丙苯 allyl benz 1-4 三種木脂素類化合物基本的母核結(jié)構(gòu)（王丹等 20Fig.1-4 Nuclear parent structure of three kinds of lignans單體主要有四種（如圖 1-3）。根據(jù)分子中苯丙化合物分為木脂素（1ignan）Ⅰ、新木脂素（nen）III（圖 1-4）。苯丙素單體的第 1 個 C6-C3單

第一章 文獻綜述 衍生物依托泊苷、替尼泊苷等已在臨床上廣泛應用于抗腫瘤和抗病毒治療（陸煒強等2011）。這些物質(zhì)主要來自鬼臼屬植物，統(tǒng)稱為鬼臼類木脂素（podophyllum lignnas）經(jīng)常食用富含木脂素的食物能夠明顯降低乳腺癌的發(fā)生率。據(jù)文獻報道，大多數(shù)植物木脂素會在腸道菌群的作用下，經(jīng)過水解、脫甲基、脫羥基、不對稱加氫等途徑，最終代謝為哺乳動物雌激素腸二醇（Enterolactone，ENL）和腸內(nèi)酯（Enterodiol，END）。ENL和 END 有預防和治療雌激素依賴性癌癥的作用。在此方面研究最多的是亞麻籽（Linumusitatissimum）木脂素-開環(huán)異落葉松脂酚（secoisolariciresinol，SECO）（楊瑞楠 2016）根據(jù)研究結(jié)果，PDG 會被腸道菌群代謝為松脂素、落葉松樹脂素、開環(huán)異落葉松脂素腸二醇、腸內(nèi)酯等 15 個代謝產(chǎn)物，推測其在腸道內(nèi)的代謝過程主要包括糖苷的水解、甲氧基基團的去甲基化、3,4-二羥基苯基的去羥基化以及呋喃環(huán)的開環(huán)裂解反應等（Xiet al. 2003）（圖 1-5）。

本文編號：2813709