【摘要】：化學性肝損傷是由化學肝毒性物質(zhì)所造成的肝損傷,能進一步發(fā)展為肝硬化甚至肝癌,嚴重威脅著人類健康。目前市場上已有許多保肝藥物,但是價格昂貴且毒副作用較大,在臨床使用上受到極大限制。因此,開發(fā)具有良好的保肝效果且毒副作用小的天然藥物是目前迫切需要解決的問題。桑葚(Mori Fructus)是植物桑(Morus alba L.)的成熟果實,收載于《中華人民共和國藥典》(2015年版,一部),具有滋陰補腎、調(diào)節(jié)免疫等功效,被譽為“民間圣果”。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)粗多糖具有減輕肝損傷的作用。但是桑葚精多糖對肝保護作用的影響,其最佳構型和“構-效”關系還尚不明確,嚴重阻礙了對桑葚多糖的全面認識,不利于桑葚多糖在新藥和功能性食品領域的發(fā)展。為解決上述問題,本課題以桑葚為原料,采用水提醇沉法得到桑葚粗多糖,再經(jīng)過DEAE-52纖維素和Sephadex G-100凝膠柱層析進一步分離、純化,最終獲得三個相對均一的多糖組分(MFP-1、MFP-2和MFP-3)。然后對MFP-1、MFP-2和MFP-3進行氧化降解、硫酸酯化修飾和羧甲基化修飾,得到相應的修飾產(chǎn)物,并采用HPLC柱前衍生法和紅外光譜法分析對桑葚多糖及其衍生物進行一級結構解析,同時評價了桑葚多糖及其衍生物對乙醇脫氫酶(ADH)活性的影響,初步篩選出具有保肝作用的桑葚多糖及其分子修飾法。最后,建立了急性酒精性肝損傷模型、刀豆蛋白A急性肝損傷和亞急性肝損傷模型,展開MFP-1及其羧甲基化衍生物對化學性肝損傷的保護作用研究。主要研究內(nèi)容及結果如下:1.桑葚多糖的提取、分離、純化。桑葚經(jīng)勻漿、熱水浸提、除雜等過程得到桑葚粗多糖。分別以蒸餾水、0.1、0.5 M NaCl溶液為洗脫液,將桑葚粗多糖通過DEAE-52纖維素柱層析分離,收集不同洗脫液洗脫組分,經(jīng)透析和冷凍干燥得到桑葚粗多糖再經(jīng)Sephadex G-100層析柱進一步純化,最后得到三個多糖組分MFP-1、MFP-2和MFP-3,凝膠滲透色譜洗脫均呈單一峰形,提示為均一多糖。2.桑葚多糖的結構解析。通過化學法和儀器分析法對各多糖組分進行理化性質(zhì)測定和結構表征,得到以下結果:(1)MFP-1分子量約為20.93 kDa,多糖含量達75.3%,硫酸基含量6.9%,糖醛酸含量為2.3%。MFP-1主要由Gal、Glc、Ara、Rha、Man等5種中性單糖組成,其摩爾比為26.8∶20.4∶8.7∶5∶1,MFP-1中主要,進一步說明MFP-1為中性多糖。(2)MFP-2分子量約為56.23 kDa,多糖含量達83.7%,硫酸基含量12.9%,糖醛酸含量為22.2%。MFP-2主要含有Ara、Gal、Rha、Glc、GalA,其摩爾比為34.2∶38.2∶8∶17.5∶15.1,在1636 cm~(-1)處出現(xiàn)寬吸收峰是-COO-非對稱伸縮振,在1039 cm~(-1)處出現(xiàn)吸收峰是吡喃環(huán)的伸縮振動,可以推測這種多糖是吡喃環(huán)結構。(3)MFP-3分子量約為118.76 kDa,多糖含量達74.3%,硫酸基含量為1.8%,糖醛酸含量為61.7%。MFP-3主要含有Glc、Gal、Rha、GalA、Ara、GlcA,其摩爾比為47.4∶34.9∶36.1∶33.1∶19.9∶4.1,紅外分析顯示MFP-3在897 cm~(-1)處出現(xiàn)吸收峰,推測這種多糖含β-糖苷鍵。另外,三種多糖含有少量蛋白質(zhì)和核酸,并遇碘液均不變色,說明均不含連續(xù)α-(1→4)Glc鍵型。3.桑葚多糖的化學修飾。采用氧化降解法、硫酸酯化修飾法和羧甲基化修飾法對桑葚多糖(MFP-1、MFP-2和MFP-3)進行分子修飾,共計得到9個修飾產(chǎn)物分別為:氧化降解產(chǎn)物(O-MFP-1、O-MFP-2和O-MFP-3)、硫酸酯化修飾產(chǎn)物(S-MFP-1、S-MFP-2和S-MFP-3)和羧甲基化修飾產(chǎn)物(C-MFP-1、C-MFP-2和C-MFP-3)。并測定各多糖的分子量、取代度(DS)和紅外光譜。結果表明,多糖氧化降解后,MFP-1分子量由20930 Da降到7460 Da,得率為30.4%;MFP-2分子量由51230 Da降到30310 Da,得率為17.7%;MFP-3分子量由118760 Da降到4189 Da,得率為21.3%,說明三種多糖均得到一定程度的降解。經(jīng)硫酸修飾后,MFP-1、MFP-2和MFP-3的DS的取代度分別為0.64、0.39和0.55,得率分別為45.9%、33.4%和52.1%。經(jīng)羧甲基化修飾后,MFP-1、MFP-2和MFP-3的DS分別為0.71、0.46和0.21,得率依次為74.2%、68.7%和73.6%。三種方法得率依次為:羧甲基化修飾硫酸化修飾氧化降解。經(jīng)紅外光譜分析:9種多糖衍生物均在3440 cm~(-1)和2927 cm~(-1)附近出現(xiàn)由-OH伸縮振動和C-H伸縮振動的吸收峰,這是多糖的特征吸收峰,說明修飾后的樣品保留了多糖的結構,硫酸酯化衍生物(S-MFP-1、S-MFP-2和S-MFP-3)在820 cm~(-1)附近出現(xiàn)吸收峰,說明多糖已被部分酯化。羧甲基化衍生物(C-MFP-1、C-MFP-2和C-MFP-3)多糖在1617 cm~(-1)和1423 cm~(-1)處出現(xiàn)新的吸峰,說明多糖已被部分羧甲基化。值得注意的是,C-MFP-1在848.21 cm~(-1)處出現(xiàn)新的吸收峰,848 cm~(-1)是吡喃糖的α型C-H振動的特征吸收峰。說明C-MFP-1可能含有α型吡喃糖。4.桑葚多糖及其衍生物對ADH活性影響的研究。本研究以ADH激活率為指標,建立體外ADH活性評價模型,分別測定修飾前后的桑葚多糖對ADH活性的影響。計算分析結果顯示,修飾前后的桑葚多糖對ADH均有一定程度地激活作用,其中C-MFP-1(6.59±0.030 mg·mL~(-1))表現(xiàn)出對ADH有較高的激活能力,這可能與多糖的結構穩(wěn)定性有關,也可能與C-MFP-1中存在的α型吡喃糖有關。5.為進一步研究桑葚多糖對化學性肝損傷的保護作用及潛在機制,開展了桑葚多糖及其羧甲基化衍生物對化學性肝損傷的作用研究。首先建立小鼠急性酒精性肝損傷、刀豆蛋白A急性肝損傷和亞急性酒精性肝損傷模型,綜合MFP-1和C-MFP-1對血清中AST、ALT、LDH、TG、LDL-C、T-CHO、TBIL和肝臟中MDA、SOD、GSH-PX肝功能指標的檢測以及病理切片的觀察,多角度、多層面分析桑葚多糖及其羧甲基化衍生物(MFP-1和C-MFP-1)對化學性肝損傷的作用。結果表明,MFP-1和C-MFP-1對化學性肝損傷都有一定的效果,其中預先服用C-MFP-1組與模型對照組對酒精性肝損傷模型的各生化指標存在顯著性差異。推測桑葚多糖及其羧甲基化衍生物抗化學性肝損傷的主要作用機制可能為,通過降低血清AST、ALT、TG代謝,提高機體對酒精代謝所產(chǎn)生的活性氧自由基的清除能力;通過抑制肝臟中MDA生成,增加肝臟中SOD和GSH-PX含量,減少由酒精產(chǎn)生的脂質(zhì)物質(zhì),抑制脂質(zhì)過氧化。
【圖文】：

技術路線圖

圖 2-8 MFP-1，2 和 3 分子量的 HPLC 色譜圖Fig.2-8 Mecular weight of MFP-1, MFP-2 and MFP-3糖的單糖組成分析
【學位授予單位】：貴州師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：TS201.4;O629.12

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本文編號：2708557