【摘要】：利用HPLC技術(shù)建立定量測定酵母發(fā)酵上清液中重組新蛭素(以下簡稱EH)的方法,該方法的建立為EH生產(chǎn)工藝的改進(jìn)提供了技術(shù)手段,通過該方法實現(xiàn)發(fā)酵過程中EH表達(dá)量的實時監(jiān)測,進(jìn)而對EH發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,改進(jìn)發(fā)酵工藝及發(fā)酵上清超濾條件,提高EH的表達(dá)量,降低時間成本和生產(chǎn)成本,提高生產(chǎn)效率。對新工藝生產(chǎn)的EH進(jìn)行質(zhì)量檢測,符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。并對EH蛋白影響因素及長期穩(wěn)定性進(jìn)行研究。主要內(nèi)容如下:建立HPLC法定量測定酵母發(fā)酵上清液中EH含量的方法,EH在214 nm處有較強(qiáng)的特異性吸收峰,其吸收峰面積與含量存在很好的線性關(guān)系,r~2=0.9995,EH線性濃度范圍在0.012~4.8 mg/mL。該測定方法具有很好的精密度,樣品多次重復(fù)測定的RSD值為1.4227%;加標(biāo)回收率在95%~98%。該方法準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好,進(jìn)行測定時,可根據(jù)EH的特異吸收峰,對發(fā)酵過程中發(fā)酵上清液中EH含量進(jìn)行實時定量測定。測定結(jié)果顯示,在一定時間范圍內(nèi),EH的表達(dá)量與誘導(dǎo)時間成正相關(guān)。對重組新蛭素發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,優(yōu)化后甲醇誘導(dǎo)時的pH為5.85,甲醇流加起始速率為每升初始發(fā)酵液體積3.6mL/h,4h左右后,流加速率增加一倍到每升初始發(fā)酵液體積7.3 mL/h。繼續(xù)流加2h后,適當(dāng)增大甲醇流速至溶氧保持在4-8%。發(fā)酵實驗結(jié)果表明,在誘導(dǎo)過程中,在一定甲醇流加量范圍內(nèi),目的蛋白表達(dá)量與甲醇流加量成正相關(guān)。在發(fā)酵后期用HPLC法定時檢測發(fā)酵上清EH的含量,一旦有下降趨勢或不再有明顯上升趨勢,立即下罐。超濾采用國產(chǎn)的中空纖維柱,下罐后離心上清先經(jīng)過50kD中空纖維過濾,去除酵母菌碎片和大分子雜質(zhì),透過液再經(jīng)3kD中空纖維進(jìn)行樣品濃縮,與超濾膜包相比極大縮短了超濾時間,降低生產(chǎn)成本,提高生產(chǎn)效率,為二期臨床藥品的生產(chǎn)制備奠定了基礎(chǔ)。對新工藝生產(chǎn)的EH進(jìn)行質(zhì)量檢測,其蛋白含量、DNA殘留、電泳分子量、電泳純度、免疫印跡蛋白鑒定、HPLC純度、抗凝活性及內(nèi)毒素檢測等均符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。對EH蛋白影響因素及長期穩(wěn)定性進(jìn)行研究,對光照、高溫、高濕及不同pH的影響因素對EH蛋白穩(wěn)定性試驗,以及對原液和成品進(jìn)行18個月長期穩(wěn)定性試驗。結(jié)果顯示,EH原液對溫度、光照較敏感,在試驗及保存過程中應(yīng)盡量低溫避光;EH成品穩(wěn)定性較好,對光照、高濕不敏感,但在高溫條件下會降解。原液可以在-80℃、-20℃中保存18個月;成品可以在-20℃、4℃中保存18個月。
【圖文】：

圖 2-1 不同紫外檢測波長（A：214 nm；B：225 nm；C：238 nm；D：280 nm）分析 EH 的HPLC 圖譜Figure 2-1 HPLC chromatograms of EH at different wavelengths (A: 214 nm; B: 225 nm; C:238 nm; D: 280 nm)2.3.2 線性關(guān)系及靈敏度考察EH（蛋白濃度 2.4 mg/mL，進(jìn)樣量為 4 μL）HPLC 圖譜（圖 2-2），，得到 12組 EH 的 HPLC 圖譜，并對其峰面積進(jìn)行積分，以 EH 蛋白濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制工作曲線，得到回歸方程 Y = 5 × 106X + 62767（r2=0.9995），結(jié)果 EH 溶液在濃度 0.012 ~ 4.8 mg/mL 范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（圖 2-3），蛋白濃度在 0.012 mg/mL 以下和 4.8 mg/mL 以上不在線性范圍內(nèi)；靈敏度考察，本實驗中 EH 的最低檢測限為 0.012 mg/mL、最高檢測限為 4.8mg/mL。

時間（min）圖 2-4 發(fā)酵液上清的 HPLC 圖譜e 2-4 HPLC chromatogram of fermentation supernata峰面積30 × 10525 × 10520 × 10515 × 10510 × 1055 × 105020 40 60 80 100 120誘導(dǎo)時間/h5 發(fā)酵上清中的 EH 峰面積與不同誘導(dǎo)時間的關(guān)系onship between peak area of EH in fermentation superninduction time
【學(xué)位授予單位】：北京工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：O657.72;TQ464

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本文編號：2692554