【摘要】：蛋白質(zhì)是組成細(xì)胞的重要成分,其靈敏和特異性檢測對于分子診斷和醫(yī)藥研究具有重要意義。轉(zhuǎn)錄因子是一種DNA結(jié)合蛋白,通過結(jié)合特定區(qū)域來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)異常會引起炎癥,癌癥等相關(guān)疾病,已成為診斷研究的標(biāo)志物。末端轉(zhuǎn)移酶是一種非模板依賴性的聚合酶蛋白,可在DNA鏈末端添加重復(fù)的核苷酸序列,是急性白血病的生物標(biāo)志物。因此,轉(zhuǎn)錄因子和末端轉(zhuǎn)移酶的靈敏和特異性檢測對于臨床診斷和病理研究具有重要的意義。目標(biāo)物結(jié)合誘導(dǎo)效應(yīng)是一種通過目標(biāo)物蛋白與DNA鏈結(jié)合,在空間上形成位阻或者改變DNA結(jié)構(gòu)從而對下一步反應(yīng)起到保護(hù)或觸發(fā)作用的策略。這種策略可將蛋白質(zhì)的特異性檢測轉(zhuǎn)化為核酸檢測,同時易于結(jié)合核酸放大方法,提高目標(biāo)物蛋白利用率,為實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)特異性靈敏檢測提供了平臺。DNA納米機(jī)器是一種利用DNA結(jié)構(gòu)可編程,多樣性以及可控性特點(diǎn)進(jìn)行的DNA納米組裝,能夠依據(jù)能量的轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)持續(xù)運(yùn)動。能量轉(zhuǎn)化通常是由鏈取代、酶反應(yīng)和環(huán)境變化引起的。DNA納米機(jī)器的研究對靶向給藥,細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)輸運(yùn),納米尺度裝配等領(lǐng)域有重要意義,可作為生物傳感器用于目標(biāo)物分析。利用目標(biāo)物結(jié)合誘導(dǎo)效應(yīng),我們構(gòu)建了對轉(zhuǎn)錄因子和末端轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行特異靈敏檢測的熒光生物傳感器。本文共分為三章:第一章為緒論,概述了結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄因子和酶蛋白末端轉(zhuǎn)移酶的檢測意義及其傳統(tǒng)檢測方法,介紹了目標(biāo)物結(jié)合誘導(dǎo)效應(yīng)的基本原理及其分類,此外介紹了DNA納米機(jī)器的概念及其發(fā)展,基于驅(qū)動機(jī)制的不同可分為三類,主要為環(huán)境因素驅(qū)動,酶驅(qū)動以及鏈取代驅(qū)動。第二章基于目標(biāo)物結(jié)合保護(hù)作用介導(dǎo)的滾環(huán)擴(kuò)增,建立一種熒光傳感器用于轉(zhuǎn)錄因子的靈敏特異性檢測。通過轉(zhuǎn)錄因子與特定DNA序列結(jié)合形成的空間位阻抑制Nt.BbvCI的切割,保證檢測的特異性。此外設(shè)計(jì)多功能發(fā)夾探針可同時用于結(jié)合目標(biāo)物,識別Nt.BbvCI,輸出信號,連接后作為滾環(huán)擴(kuò)增模板,避免了多種探針的復(fù)雜設(shè)計(jì)以及添加模板所帶來的非特異性擴(kuò)增。本方法實(shí)現(xiàn)了對目標(biāo)物TBP的靈敏檢測,檢測限低至88 pM,線性范圍為100 pM到40 nM,展現(xiàn)了較高的特異性。第三章基于目標(biāo)物結(jié)合誘導(dǎo)延伸構(gòu)建一種DNA walker納米機(jī)器用于末端轉(zhuǎn)移酶檢測。通過目標(biāo)物末端轉(zhuǎn)移酶與W鏈的3'羥基末端結(jié)合,誘導(dǎo)其延伸生成具有活性位點(diǎn)的walker鏈從而啟動DNA納米機(jī)器。同時利用λexo切割基質(zhì)鏈驅(qū)動熒光團(tuán)不斷釋放,放大檢測信號,實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物的靈敏檢測。目標(biāo)物未與W鏈結(jié)合時無法產(chǎn)生活性位點(diǎn),有效避免非特異性啟動帶來的背景信號。本方法的檢測限為7 U/mL,且具有較高的特異性。
【圖文】：

三螺旋結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)也被應(yīng)用于結(jié)合誘導(dǎo)的構(gòu)象轉(zhuǎn)變中，如Ｊｉａｎｇ課題組巧妙逡逑設(shè)計(jì)一種Ａｇ＋穩(wěn)定的三螺旋結(jié)構(gòu)，然后結(jié)合目標(biāo)物誘導(dǎo)構(gòu)成一種可開可關(guān)的分子逡逑組裝實(shí)現(xiàn)了邋ＴＦ的檢測３２，如圖１．２，，ＤＮＡ雙鏈上含有ＴＦ的結(jié)合位點(diǎn)，且與單逡逑鏈ＤＮＡ結(jié)構(gòu)有部分重疊的相似堿基，單鏈的結(jié)構(gòu)可以和雙鏈共同形成三螺旋結(jié)逡逑構(gòu)，而Ａｇ＋在這個過程中起到了增加結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的效果，這時兩種信號分子會由逡逑于距離的拉近發(fā)生ＦＲＥＴ，不發(fā)熒光。ＴＦ存在時，與雙鏈ＤＮＡ有較強(qiáng)的結(jié)合作逡逑用力使三螺旋結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定將寡核苷酸鏈取代下來，這種作用力破壞了穩(wěn)定的三螺逡逑旋結(jié)構(gòu)，使其又變成雙鏈完成結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，信號分子相互遠(yuǎn)離恢復(fù)熒光。這種構(gòu)象逡逑轉(zhuǎn)變過程其實(shí)是目標(biāo)物誘導(dǎo)的結(jié)合競爭，通過熒光分子開關(guān)實(shí)現(xiàn)對ＴＦ的特異性逡逑檢測。逡逑0邋＋邐￣￣＾邋４邋＋邋＞逡逑＞邋＾邋ｉＨ邋Ｐ邋＂逡逑ｒ邐％逡逑ＢＨＱ－１ＴＴＯ邐ＡＴ邋ＳＴ１＞ＭＳ邐0？＊逡逑＂Ｔｔｔｒａ邋ｏｆＴ逡逑圖１．２目標(biāo)物結(jié)合誘導(dǎo)ＤＮＡ競爭結(jié)合３２逡逑３逡逑

對ＤＮＡ單鏈進(jìn)行末端切割的一種外切酶，可對３’突出末端進(jìn)行逐步降解。逡逑Ｚｈａｎｇ課題組基于目標(biāo)物結(jié)合誘導(dǎo)保護(hù)的原理結(jié)合Ｅｘｏ邋ＩＩＩ和Ｅｘｏ邋Ｉ切割過程逡逑建立ＴＦ的放大檢測策略３３，如圖１．３所示，ＴＦ與發(fā)夾莖部結(jié)合后會產(chǎn)生強(qiáng)大的逡逑空間位阻，阻礙Ｅｘｏ邋ＩＩＩ對３’平末端的切割降解過程，從而保護(hù)與目標(biāo)物識別的逡逑發(fā)夾探針，發(fā)夾隨后與引物堿基配對，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定后與聚合酶結(jié)合在末端添加互補(bǔ)逡逑序列，得到雙鏈ＤＮＡ，此時再加入ＤＮＡ解旋酶，雙鏈從兩端發(fā)生解旋再次與引逡逑物聚合酶作用完成雙鏈擴(kuò)增過程，最后在雙鏈ＤＮＡ中插入熒光信號分子完成檢逡逑測。而沒有與目標(biāo)物結(jié)合的過量識別探針則會經(jīng)兩種外切酶共同作用逐步降解為逡逑ＤＮＡ碎片。逡逑９９９邐＂邋ｍ邐＇＂ｔ逡逑Ｐｙ邋ｈ邋Ｍ－邐（邋Ｈｅｌｉｃａ＾ｎｄｅｎｔ逡逑ｌ邐ａｍｐｕｆｉｃａｔｉｏｎ邐Ｊ逡逑Ｅｘｏ邋ＨＩ邋｜邋Ｅｘｏ邋Ｉ邐＾邋ｗ逡逑ｔ邐￣＞ＴＴＴＴＴ７ｍｇ３逡逑５３＇邋５１邋ｆ逡逑Ｉ邋ＩＩｅ＞ｔ邐＜邋Ｈｃｌｋ咖逡逑Ｉ邋Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ逡逑＾邋＊邐Ｐｒｉｍｅｒ逡逑Ｙ邋＾邐？邐５，逡逑Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ逡逑圖１．３目標(biāo)物結(jié)合外切酶保護(hù)分析３３逡逑目標(biāo)物結(jié)合形成的空間位阻抑制外切酶切割，Ｚｈａｎｇ課題組也利用此原理逡逑建立一種ＴＦ的放大檢測方法３４，當(dāng)ＴＦ存在時，與識別探針結(jié)合形成空間位阻逡逑可以抑制Ｅｘｏ邋ＩＩＩ的非特異性切割
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：O657.3

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本文編號：2684057