發(fā)布時(shí)間：2020-05-22 10:08

【摘要】：組織樣品中的蛋白質(zhì)鑒定一直是生物學(xué)研究領(lǐng)域的一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的課題�；贚C-MS/MS平臺(tái)的經(jīng)典蛋白質(zhì)組學(xué)雖然可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的深度覆蓋,從而提供全面的數(shù)據(jù)信息,但在樣品制備過程中往往丟失了蛋白質(zhì)分子的空間信息。近年來,蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)于組織樣品的空間分辨分析提出了更高的要求。雖然質(zhì)譜成像技術(shù)解決了空間分辨分析的問題,但由于質(zhì)譜技術(shù)的限制,理解質(zhì)譜數(shù)據(jù)背后的生物學(xué)意義依舊十分困難。因此,目前迫切需要一種空間分辨的蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法。在本論文中,我們分別建立了聚丙烯酰胺晶膠原位酶解和L-賴氨酸硅膠棒固定化酶探針兩種原位酶解方法,實(shí)現(xiàn)了空間分辨的蛋白質(zhì)組學(xué)分析。全文包含以下幾個(gè)部分:論文的第一章主要闡述了目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中面臨的問題和挑戰(zhàn),對(duì)經(jīng)典蛋白質(zhì)工作流中的樣品制備方法進(jìn)行了綜述,并對(duì)現(xiàn)有的空間分辨蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)進(jìn)行了總結(jié)。提出了本論文的研究目的在于實(shí)現(xiàn)空間分辨的蛋白質(zhì)組學(xué)分析,并對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行更深度的覆蓋。論文的第二章中,我們利用聚丙烯酰胺晶膠原位酶解技術(shù),將樣品酶解和采樣結(jié)合在一起,實(shí)現(xiàn)了空間分辨的蛋白質(zhì)組學(xué)采樣和分析。實(shí)驗(yàn)表明,管內(nèi)聚合方式制備的聚丙烯酰胺晶膠尺寸更精準(zhǔn)且容易操作。6%的聚丙烯酰胺晶膠孔徑更大,具有更高的傳質(zhì)效率和負(fù)載量,在原位酶解蛋白質(zhì)時(shí)表現(xiàn)更優(yōu)。聚丙烯酰胺晶膠原位酶解采樣技術(shù)的最小采樣尺寸可達(dá)92 m,鑒定蛋白質(zhì)數(shù)為450。成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)大鼠皮質(zhì)層和紋狀體的空間分辨蛋白質(zhì)組學(xué)分析。論文的第三章中,我們利用L-賴氨酸硅膠棒固定化酶探針進(jìn)行了空間分辨蛋白質(zhì)組學(xué)分析的嘗試。我們利用L-賴氨酸作為單體化合物,3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)和四甲氧基硅烷(TMOS)共同作為溶膠-凝膠反應(yīng)前體,制備了雜化硅膠整體材料,采用交聯(lián)劑戊二醛在整體材料上共價(jià)鍵合胰蛋白酶,獲得雜化硅膠整體固定化酶反應(yīng)器。實(shí)驗(yàn)表明這種固定化酶反應(yīng)器通透性較好,交聯(lián)度較高,機(jī)械強(qiáng)度較高。固定化酶反應(yīng)器酶解標(biāo)準(zhǔn)蛋白牛血清白蛋白時(shí)得到的序列覆蓋度高達(dá)94.4%,這顯示出它對(duì)復(fù)雜樣品的分析有巨大的潛質(zhì)。這部分工作中,我們成功利用液滴微流控技術(shù)制備了 L-賴氨酸硅膠棒,并將其固定到毛細(xì)管中,制備了 L-賴氨酸硅膠棒固定化酶探針,但由于硅膠棒孔徑較小、采樣接觸面積較小、且存在較大的采樣位阻,無法實(shí)現(xiàn)很好的原位酶解采樣。論文的第四章總結(jié)了本論文的研究工作,對(duì)不足之處進(jìn)行了探討,并對(duì)為了進(jìn)一步的研究工作進(jìn)行了展望。
【圖文】：

0逡逑常見的蛋Ａ質(zhì)組學(xué)樣品制備步驟分為：樣品采集、樣品勻漿化、蛋內(nèi)質(zhì)提取、逡逑蛋白質(zhì)酶解，如圖１．２所示。逡逑樣品采集逡逑細(xì)胞逡逑—邐樣品勻漿化邐蛋白質(zhì)提取邐蛋白質(zhì)酶解逡逑Ｉ邋—備一巧逡逑體液邐罾逡逑Ｖ邐Ｊ逡逑圖１．２常見的蛋白質(zhì)組學(xué)樣品制備步驟逡逑１．２．１樣品采集逡逑常見的蛋白質(zhì)組學(xué)樣品分為體液、細(xì)胞、微生物和組織，樣品采集一般是粗逡逑放式大質(zhì)量的直接采樣。體液是最容易采集的樣品，通常直接從生物體中抽取，逡逑如血液、腦脊液和唾液等的采集方法；細(xì)胞或微生物則需要進(jìn)行有目的的培養(yǎng)，逡逑在進(jìn)行樣品處理前需要將細(xì)胞或微生物與培養(yǎng)基分離；而組織則根據(jù)Ｉ〗的的不同，逡逑有些實(shí)驗(yàn)需要對(duì)整個(gè)器官或部分組織進(jìn)行采集，而有些臨床上的病理學(xué)檢查則只逡逑需要進(jìn)行少量組織穿刺。對(duì)于經(jīng)典蛋白質(zhì)組學(xué)分析來說，由于蛋白質(zhì)的復(fù)雜性和逡逑多樣性，采集的樣品量不能過少，否則后續(xù)分析鑒定將面臨

ＡＶ？＂邋Ｖｔ＊．邐、－逡逑第一章前目體采樣是一個(gè)比較特殊的領(lǐng)域，ＳＰＭＥ因其獨(dú)特的采樣方式及在此領(lǐng)域得以應(yīng)用。面向活體的ＳＰＭＥ裝置一般設(shè)計(jì)為類似樣器（頂空進(jìn)樣）或是金屬的針狀探針［６５］（用于直接采樣），如是將具有吸附涂層的萃取纖維暴露在樣品中直接進(jìn)行萃取。經(jīng)后，將ＳＰＭＥ探針直接放到氣相色譜熱脫附或使用溶劑解吸進(jìn)行分析。隨著近些年檢測儀器分析靈敏度的極大提高，上述分鐘甚至幾秒鐘迅速完成。逡逑
【學(xué)位授予單位】：廈門大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：O657.3

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本文編號(hào)：2675835