【摘要】：細胞表面的寡糖參與了細胞內(nèi)一系列的生命活動進程,其中含有末端N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)殘基的寡糖在參與作為細胞粘附、腫瘤的遷移、腦神經(jīng)的發(fā)育以及病毒成功侵入機體中起重要作用,現(xiàn)今已成為糖生命科學中研究的重點領域之一。而獲得足夠的唾液酸化寡糖成為探索其功能的基礎與關鍵。目前,雖然化學合成唾液酸化寡糖的方法已經(jīng)基本確定,但其由于需要繁瑣的基團保護和去除步驟,立體選擇性差,并且合成的寡糖價格昂貴。而酶法合成唾液酸化寡糖雖然具有高度立體選擇性和區(qū)域選擇性,但是需要昂貴的三磷酸胞苷(CTP)和唾液酸化寡糖前體(CMP-Neu5Ac)作為底物。新近發(fā)展起來的全細胞合成技術,雖然可以實現(xiàn)寡糖在細胞內(nèi)合成,但是由于合成的唾液酸化寡糖全部積累在細胞內(nèi),造成產(chǎn)量極低。因此,如何建立CTP和CMP-Neu5Ac的廉價合成以及唾液酸化寡糖的胞外催化合成技術與方法是實現(xiàn)唾液酸化寡糖工業(yè)化生產(chǎn)的關鍵。首先,篩選高效催化胞苷酸CMP合成CTP的酵母,并優(yōu)化游離酵母全細胞催化體系,實現(xiàn)由廉價CMP到CTP的高效合成。通過篩選不同種類酵母得到催化CMP合成CTP能力最強的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S189,并在此基礎上進行涵蓋CMP濃度、葡萄糖濃度、pH及溫度四個因素的搖瓶優(yōu)化。確定優(yōu)化的反應體系為:CMP濃度為40 mmol·L~(-1),葡萄糖濃度為120 mmol·L~(-1),pH為8,溫度為37°C,終轉化率達到84%,相對優(yōu)化之前提高了53%。其次,建立優(yōu)化CMP-Neu5Ac合成酶高效表達與CMP-Neu5Ac催化合成的反應體系。將CMP-Neu5Ac合成酶(NeuA酶)的編碼基因neuA分別連接到載體pET28a和pFLAG得到重組質(zhì)粒pET28a-neuA和p FLAG-neuA,分別轉化大腸桿菌(Escherichia coli)BL21(DE3),IPTG誘導表達,通過分析CMP-Neu5Ac的合成量來評估不同載體系統(tǒng)所表達NeuA酶的比活力并優(yōu)化催化反應體系。最終確定轉化重組質(zhì)粒pFLAG-neuA的E.coli BL21(DE3)在初始IPTG誘導濃度0.5 mmol·L~(-1),30°C條件下培養(yǎng)15 h酶活最高;E.coli BL21(DE3)-pFLAG-neuA所表達的NeuA酶比活力是13.5 U·mg~(-1),E.coli BL21(DE3)-pET28a-neuA為7.5 U·mg~(-1);通過對CMP-Neu5Ac合成進行優(yōu)化,得到CMP-Neu5Ac合成最適溫度和最適pH分別為38°C和9,最適反應時間為3 h,終產(chǎn)量為2.6 mmol·L~(-1),與優(yōu)化前相比提高了23%。最后,建立唾液酸化寡糖雙酵母耦合催化體系。將α-2,3-唾液酸化寡糖轉移酶的編碼基因ST23連接表面展示載體pYD1得到重組質(zhì)粒pYD1-ST23,通過不含色氨酸的SD培養(yǎng)基和菌落PCR篩選得到轉化成功的重組菌株EBY100-pYD1-ST23,以YNB-CAA-Glc為發(fā)酵培養(yǎng)基,25°C條件下進行誘導表達,將得到的菌液與S.cerevisiae S189酵母泥及重組菌株E.coli BL21(DE3)-pFLAG-neuA的粗酶液按比例1:1:1(v:m:v)混勻,在此基礎上將混合菌液與反應液(CMP 10 mmol·L~(-1),Neu5Ac 10 mmol·L~(-1),Lactose 10mmol·L~(-1))按體積比1:1充分混勻,30°C條件下反應2 h后通過薄層色譜法(TLC)成功檢測到α-2,3-唾液酸化寡糖的生成。
【圖文】：

圖 1-1 CTP 的分子結構Fig. 1-1 The molecular structure of CTP內(nèi)的一種正常組分，通過參與核酸、磷脂類及蛋直接穿過血－腦脊液屏障，，它是核酸代謝與磷脂類。還可以增強神經(jīng)細胞及血管壁細胞膜性結構的合

圖1-2 CTP合成反應機理Fig. 1-2 The mechanism of CTP synthesis表面多糖面有許多種多糖，這種多糖在它們與周圍環(huán)境的相互作用起
【學位授予單位】：江南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：TQ926;O629.1

【參考文獻】

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本文編號：2644541