【摘要】：GDP-巖藻糖,即二磷酸鳥苷巖藻糖,是一種核苷酸糖,作為糖基供體和代謝中間體廣泛存在于各類生物中。在真核生物體內(nèi),它主要作為蛋白質(zhì)糖基化的重要糖基供體和合成其他糖核苷酸的前體,為巖藻糖基化反應(yīng)中提供巖藻糖基,是生命代謝調(diào)節(jié)過程中不可或缺的重要物質(zhì);在工業(yè)生產(chǎn)中,GDP-巖藻糖作為合成人乳寡糖的重要中間產(chǎn)物,在人乳寡糖的合成中具有重要的作用,擁有廣闊的市場發(fā)展前景。因此,合成GDP-巖藻糖具有重要理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。本論文的主要研究結(jié)果如下:1.本研究從大腸桿菌K-12基因組中克隆得到GDP-巖藻糖合成相關(guān)酶基因manB,從大腸桿菌BL-21(DE3)基因組中克隆得到GDP-巖藻糖合成相關(guān)酶基因manC、gmd、fcl,分別將基因與pGEX-4T-1、pGEX-4T-2、pGEX-6P-1、pGEX-6P-1載體連接,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL-21(DE3)中獲得重組菌株。重組菌株在25~oC下0.1 mM IPTG誘導(dǎo)24 h,可實(shí)現(xiàn)重組蛋白的可溶性表達(dá)。破碎后的粗酶液經(jīng)過GST-Sefinose Resin親和層析純化,得到純度較高的GDP-巖藻糖合成相關(guān)重組酶。質(zhì)譜檢測酶轉(zhuǎn)化底物結(jié)果顯示,manB-pGEX-4T-1不能將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物,其余3種蛋白純化效率較低,分別為1.0%,1.6%,5.17%,因此,需要高效表達(dá)并純化GDP-巖藻糖合成相關(guān)重組蛋白。2.成功構(gòu)建manB-pET-28a-BL21(DE3)、manC-pET-28a-BL21(DE3)、gmd-pET-28a-BL21(DE3)和fcl-pET-28a-BL21(DE3)重組工程菌株。mpglk-pET-28a-BL21(DE3)由蘇州弘訊生物科技有限公司全序列合成,經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后均實(shí)現(xiàn)了蛋白的可溶性表達(dá)。對GDP-巖藻糖合成相關(guān)酶的產(chǎn)量從載體、培養(yǎng)基、IPTG誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時(shí)間4個(gè)方面進(jìn)行了優(yōu)化。通過對TB培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基的對比,選擇TB培養(yǎng)基為重組菌株的生長提供營養(yǎng)成分。通過對IPTG誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化,分別得到了最佳的蛋白表達(dá)條件,mpglk為0.02 mM、48 h,manB為0.08 mM、48 h,manC為0.04 mM、36 h,gmd為0 mM、36 h,fcl為0.08 mM、36 h。最終優(yōu)化后5種GDP-巖藻糖合成相關(guān)酶的產(chǎn)量分別是未優(yōu)化的1.58、2.27、3.31、3.80和3.79倍。3.對GDP-巖藻糖合成過程中間產(chǎn)物甘露糖-6-磷酸的合成進(jìn)行了優(yōu)化,確定了合成甘露糖-6-磷酸的最佳反應(yīng)條件:5 mM甘露糖,10 mM六偏磷酸鈉,5 mM MgCl_2,0.5mg/mL mpglk,100μL PBS緩沖體系,37~oC反應(yīng)8 h。甘露糖-6-磷酸的產(chǎn)率達(dá)到80%。簡化了第三步中間產(chǎn)物GDP-甘露糖的合成步驟,即同時(shí)在反應(yīng)體系中加入底物甘露糖和mpglk、manB、manC,37~oC反應(yīng)12 h,可生成GDP-甘露糖;比較并優(yōu)化了三種GDP-巖藻糖的合成路線,得到產(chǎn)率最高的合成路徑。即同時(shí)在反應(yīng)體系中加入底物甘露糖、磷酸供體GTP、mpglk、manB和manC,反應(yīng)12 h,加入gmd 37~oC反應(yīng)2 h,最后加入fcl 37~oC反應(yīng)2 h,GDP-巖藻糖達(dá)到最高轉(zhuǎn)化率1.50%。
【圖文】：

在細(xì)胞質(zhì)中合成，但 CMP-唾液酸除外，它是先在細(xì)胞核中合成，之后轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中。核苷酸糖是核苷二磷酸或核苷一磷酸與不同單糖異頭碳羥基形成的衍生物[21]，是糖類合成或相互轉(zhuǎn)換時(shí)的活化形式，核苷酸糖在二糖和多糖合成過程中起非常重要的作用如圖 1-1（a）所示，為核苷酸糖的結(jié)構(gòu)通式，以及兩種常用的化學(xué)合成核苷酸糖的方法[22]。合成核苷酸糖最重要的是連接糖和核苷之間的磷酸鍵，最常用的是使用糖-1-磷酸（糖-1-P）和活化的核苷單磷酸（NMP）進(jìn)行焦磷酸化（1-1（a），途徑 b），也可通過使用帶有糖基供體的核苷二磷酸（NDP）直接糖基化來制備（1-1（a），途徑 a）。在動物細(xì)胞中[23]，最常見的核苷酸糖類型為含尿苷或鳥苷的核苷二磷酸（UDP 或 GDP）與一些糖相連，包括戊醛糖，如尿苷二磷酸-木糖（UDP-Xyl）；己醛糖，如尿苷二磷酸葡萄糖，尿苷二磷酸-半乳糖（UDP-Glc，UDP-Gal）；己醛糖胺，如尿苷二磷酸- N-乙酰葡糖胺，尿苷二磷酸- N-乙酰半乳糖胺（UDP-GlcNAc，UDP-GalNAc）和糖醛酸如尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸（UDP-GlcA）組分。這些在常見哺乳動物中常見的核苷酸糖例子如圖 1-1（b）左側(cè)所示[24]。在細(xì)菌中[25]也發(fā)現(xiàn)了的一些核苷酸糖，例如鳥苷二磷酸-甘露糖（GDP-ManA），尿苷二磷酸-呋喃半乳糖（UDP-Galf）和鳥苷二磷酸-D-鼠李糖（GDP-D-Rha）。

圖 1- 1（b） 哺乳動物和細(xì)菌體內(nèi)核苷酸糖動物細(xì)胞中的糖基化主要由三種組分構(gòu)成[26]：糖殘基的受體，供體和位于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面和高爾基體不同區(qū)域中的高特異性糖基轉(zhuǎn)移酶。糖殘基的受體可以是蛋白質(zhì)，脂質(zhì)或其他簡單和復(fù)雜的糖。核苷二磷酸糖（NDP）可以充當(dāng)糖殘基的供體[27]。NDP 可以含有腺嘌呤（A）、鳥嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）或尿嘧啶（U）作為含氮堿基。共含有有超過 50 種不同的 NDP。 NDP 主要在細(xì)胞質(zhì)中核苷三磷酸和 1磷酸糖相互作用時(shí)產(chǎn)生。在動物組織中，每個(gè)單糖只對應(yīng)于某一種核苷二磷酸，更嚴(yán)格地對應(yīng)于其雜環(huán)堿基[28]。因此，對于 L-巖藻糖而言，GDP-巖藻糖為唯一的供體；L-鼠李糖則對應(yīng) TDP-鼠李糖；而葡萄糖的供體是 UDP-葡萄糖。相反，植物和細(xì)菌含有多個(gè)核苷二磷酸的供體。例如，葡萄糖可以與 UDP（二磷酸尿苷），，GDP（二磷酸鳥苷），ADP（二磷酸腺苷）和 CDP（二磷酸胞苷）結(jié)合。植物細(xì)胞含有一組負(fù)責(zé)產(chǎn)生不同的葡萄糖結(jié)合核苷酸的酶[29]，這些核苷二磷酸在更復(fù)雜的碳水化合物的生物合成期間作為葡萄糖殘基的供體。NDP 不僅具有比產(chǎn)物更大的自由能，還擁有特異性糖基轉(zhuǎn)移酶可識別的個(gè)體構(gòu)象[30]。因此可以作為糖殘基的供體參與到糖基化的過程中。
【學(xué)位授予單位】：東北師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：Q78;O629.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 喻小春;酶法合成甘露糖-6-磷酸[D];北京化工大學(xué);2016年

本文編號：2621182