【摘要】：酶作為一種高效的生物催化劑,具有高效性、強專一性等特點,許多難以進行的有機反應在酶的催化下都能順利完成。然而,對于非專一性底物,酶催化往往無法實現其高效轉化。因此,如何調控酶結構強化其對非專一底物的催化轉化是近些年來生物化學以及催化化學等領域的研究熱點。本論文利用介孔二氧化硅材料構筑固定化酶催化劑,利用限域空間內固定化酶的界面活性效應強化其對非專一性底物的催化活性。通過調控介孔二氧化硅的幾何微環(huán)境(孔道形狀、孔道尺寸)以及化學微環(huán)境(表面親疏水性),深入研究限域空間內固定化酶的界面活化效應。主要研究工作如下:1、利用具有二維六方孔道結構的介孔SBA-15以及三維籠狀孔道結構的介孔MCF作為載體,控制孔道尺寸相近的條件下(～11 nm),構筑固定化黑曲霉脂肪酶催化劑SBA-15-ANL與MCF-11-ANL,關聯(lián)限域空間的孔道形狀與反應活性。在催化非專一性底物對氟苯亞甲基丙二腈合成4-H吡喃類藥物的反應中,固定化酶SBA-15-ANL(174.6 U g-1)與MCF-11-ANL(246.9 Ug-1)均得到了高于游離酶(64.2 Ug-1)的活性。利用熒光光譜和衰減全反射(ATR)-FTIR研究三級結構和二級結構,結果表明不同孔道形狀載體對酶界面活化作用,界面活化作用依賴于限域效應,三維籠狀MCF-11可以為酶提供更強的界面活化效應;2、利用具有三維籠狀孔道結構的介孔SBA-16和MCF作為載體,構筑固定化黑曲霉脂肪酶催化劑,調控限域空間的孔道尺寸(8、11、23、31 nm),關聯(lián)限域空間的孔道尺寸與反應活性,深入研究限域空間內固定化酶的界面活化效應。在催化非專一性底物對氟苯亞甲基丙二腈合成4-H吡喃類藥物的反應中,反應活性隨著孔徑增加存在最優(yōu)值,當孔道尺寸為11nm時,MCF-11-ANL催化活性高達246.9Ug-1。熒光光譜研究表明活性依賴于三維結構Trp微環(huán)境的極性,ATR-FTIR研究表明α-螺旋含量的增加量和β-轉角含量的減少量依賴于孔道尺寸,并給出了可能的活性位點氨基酸相對位置的變化情況以及對底物在活性中心的結合方式;3、利用具有三維籠狀介孔二氧化硅MCF表面羥基的可修飾性,分別對其表面進行后接枝修飾不同鏈長的疏水烷基,構筑了不同疏水性質的化學微環(huán)境,用于催化非專一性底物對氟苯亞甲基丙二腈合成4-H吡喃類藥物的反應中,與未改性載體MCF-23(173.3 Ug-1)的活性相比,甲基改性的微環(huán)境MCF-23-CH3-ANL的活性最優(yōu)(233.7 U g-1),但隨著疏水鏈的增長,活性會有一定程度的降低(121.9、92.2、54.8、33.5 Ug-1),表明隨著疏水性進一步增太強活性降低;利用熒光光譜和ATR-FTIR研究三級結構和二級結構,結果表明界面活化作用隨著載體表面疏水性增加增強,疏水改性更有利于酶二級結構的保持;4、進一步研究組裝催化劑MCF-23-ANL的重復使用性能,重復使用性研究表明使用5次后MCF-23-ANL仍然能保持72%的初始活性;底物普適性研究表明,MCF-23-ANL還可催化對硝基苯亞甲基丙二腈、對氯苯亞甲基丙二腈、苯亞甲基丙二腈、對羥基苯亞甲基丙二腈底物的反應,對帶有吸電子取代基的底物具有更好的反應活性。
【圖文】：

＝５％）作為溶劑，如表１－１邋（ｅｎｔｒｙ邋４）所示，使用ＰＰＬ水解酶催化２－丁酮和４－硝基苯甲逡逑醛不對稱加成反應，獲得高達４６．９邋％的產率。逡逑此外，他們對水解酶催化非專一性底物的機制進行了推斷［２５］。如圖１－３所示，首逡逑先，丙酮首先被Ａｓｐ－Ｈｉｓ殘基組成的二元催化中心和氧陰離子洞穩(wěn)定；隨后，Ｈｉｓ殘逡逑基從丙酮捕獲質子并形成一個烯醇離子，隨后，烯醇離子和另一活化底物醛發(fā)生親核逡逑加成，形成碳－碳鍵，最終產物從氧離子洞釋放出來。逡逑Ｈｉｓ邐Ｈｉｓ邐Ｈｉｓ逡逑ＨｉＳ＼邐－邐Ｏ邋ＡｓＰ＼邋ｒｉ邋／＝＼邐Ａｓｐｖ邋－逡逑、。力丫邋Ｈ？＇ｈ邋４卜么—卜逡逑Ｏｘｖａｎｉｏｎｈｏｌｃ邋Ｈ邋°＾Ｈ邐／Ｈ邋Ｈ邋Ｈ．邐Ｏｘｖａｎｉｏｎ邋ｈｏｌｅ邋Ｈ邋Ｈ逡逑＇？邋＼邐Ｉ邐Ｉ邋＼逡逑圖１－３脂肪酶催化Ａｌｄｏｌ加成反應可能的機理ｔ２５】逡逑Ｆｉｇ．邋１－３邋Ｔｈｅ邋ｐｏｓｓｉｂｌｅ邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍ邋ｏｆ邋Ａｌｄｏｌ邋ａｄｄｉｔｉｏｎ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ｃａｔａｌｙｚｅｄ邋ｂｙ邋ｌｉｐａｓｅ逡逑１．２．１．２邋Ｍｉｃｈａｅｌ邋ａｄｄｉｔｉｏｎｓ邋反應逡逑Ｍｉｃｈａｅｌ加成的典型代表是親核試劑１．４－共軛加成在ｃｔ，ｐ－不飽和羰基化合物的反逡逑應ｔ２６，２＇是通過１，４－加成形成新Ｃ－Ｃ鍵的最基礎和最有用的方法之一，近幾年來在合逡逑成中通過生物蛋白酶催化Ｍｉｃｈａｅｌ加成引起了科學家門的研究興趣。早在八十年代，逡逑Ｋｉｔａｚｕｍｅ等指出水解酶在緩沖液中具有催化硫醇和胺與不飽和羰基化合物邁克爾逡逑加成的能力，然而，只有在過去十年，更多關于酶邁克爾加成的報道才開始出現［２９，３１，逡逑３１］

（３－不飽和醛和酮等，作為受體與１，３－二羰基化合物或環(huán)己嗣反應產率高達逡逑８５邋％。２０１２年，何等Ｗ發(fā)現４－羥基香豆素與ａ，ｐ不飽和烯酮之間的反應，用于制備一逡逑種有效的抗凝血劑華法林及其衍生物，如圖１－４邋ｂ所示，這是第一個生物催化劑用于逡逑制備華法林及其衍生物的例子。研究表明ＰＰＬ不僅可以催化不對稱ａｌｄｏ丨反應，也可逡逑以催化Ｍｉｃｈａｅｌ加成反應。通過系統(tǒng)地研究ＰＰＬ催化的邁克爾華法林合成參數的影響逡逑得到中等到產率（高達９５邋％）和一定對映選擇性丨ｅｅ值高達２８邋％）。脂肪酶均被用于逡逑催化邁克爾加成，只有個別脂肪酶產率高達９５％，大多數酶的產率較低，但是依然取逡逑得了很大的成果。逡逑0邋0逡逑Ｑ＾Ｎ0Ｊ邋＋邋Ｘａｏｅ，逡逑ｏ逡逑＾邐Ｎ0邐９邐９邐■邐ＬｔＯ邋－邋ＯＫＩ逡逑２邋＋邋Ｋｔ0＾0Ｅｔ逡逑ｏ邋ｏ逡逑0邋（）邐Ｅｔ（）人邋ｒ邋0Ｅｔ逡逑ｉ邋ｔｏ邋ｆ邋Ｏｕｔ逡逑Ｂｒｉｙ０２邋＋邐＾邋0ｉ＾Ｎ0２逡逑ＯＨ邐ＯＨ邋Ｒ邋Ｏ逡逑ＱＣ＾ＸＨ邋＋邋Ｒ、人邋ＤＭＳＯ／Ｈ２Ｇ．Ｉ４４，ｈ逡逑圖１－４脂肪酶催化的（ａ）丨，３－二羰基化合物和酮的Ｍｉｃｈａｅ丨加成反應及（ｂ）邋４－羥基香豆素與ａ，ｐ不飽逡逑和烯酮的Ｍｉｃｈａｅｌ加成反應逡逑Ｆｉｇ．邋１－４邋（ａ）邋Ｍｉｃｈａｅｌ邋ａｄｄｉｔｉｏｎ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｔｙｐｅｓ邋ｏｆ邋１，３－ｄｉｃａｒｂｏｎｙｌ邋ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ邋ａｎｄ邋ｋｅｔｏｎｅ邋ａｎｄ邋（ｂ）逡逑Ｍｉｃｈａｅｌ邋ａｄｄｉｔｉｏｎ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋４－ｈｙｄｒｏｘｙｃｏｕｍａｒｉｎ邋ａｎｄ邋ａ
【學位授予單位】：北京化工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：O643.36;TQ460.4

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本文編號：2602201