發(fā)布時間：2019-11-13 19:14

【摘要】：以羧基化CdTe/ZnSe量子點熒光微球為標記物,通過1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)活化法將氯霉素(CAP)單克隆抗體與量子點熒光微球偶聯(lián)制備熒光探針。氯霉素全抗原(CAP-HS-BSA)及羊抗鼠二抗分別噴涂硝酸纖維素膜,形成檢測線(T線)和質(zhì)控線(C線),組裝成新型氯霉素量子點熒光微球免疫層析試紙條,建立了快速、定量檢測牛奶中CAP的方法。本研究開發(fā)的量子點熒光微球試紙條可在15min內(nèi)完成牛奶樣品中CAP的定量檢測,線性范圍為0.1~100.0μg/L,檢出限為0.1μg/L。牛奶樣品CAP的加標回收率為93.3%~97.9%,相對標準偏差在4.9%~6.9%之間。
【圖文】：

圖1QBs熒光試紙條檢測氯霉素的原理圖。(A)試紙條組裝結(jié)構(gòu)圖;(B)試紙條結(jié)果示意圖Fig．1Schematicillustrationofquantumdotsubmicrobeads(QBs)-basedimmunochromatographicteststrip(ICST)forchloramphenicol(CAP)detection:(A)structureofQBs-basedICTS;(B)schematicdiagramofCAPdetectionbyQBs-basedICTS2．6實際牛奶樣品分析通過在陰性牛奶中的加標回收實驗，評價QBs熒光試紙條的準確性以及精密度，加標濃度為0．1和10μg/L。為了進一步評價開發(fā)的QBs熒光試紙條的實用性，研究分析了30份加標牛奶樣品(10份牛奶加標濃度為0．1μg/L，10份牛奶加標濃度為10μg/L，其余10份為陰性對照)，并將實驗結(jié)果與商品化ELISA試劑盒的檢測結(jié)果進行對比。3結(jié)果與分析3．1半抗原CAP-HS和全抗原CAP-HS-BSA的鑒定采用HPLC分析半抗原CAP-HS的合成效果。結(jié)果表明，CAP色譜峰保留時間為8．0min(圖2A)，CAP-HS的保留時間為9．5min(圖2B)。BSA(500μg/mL)、CAP-HS-BSA(500μg/mL)及CAP-HS(50μg/mL)在220～340nm范圍內(nèi)的紫外光譜圖如圖2C所示，CAP-HS-BSA和BSA在280nm左右均有一個吸收峰，但是相同蛋白濃度的CAP-HS-BSA在280nm的吸光值是BSA吸光值的數(shù)倍，這是由于BSA與CAP-HS偶聯(lián)后吸光值疊加的緣故，因此可以初步判定CAP-HS與BSA偶聯(lián)成功。SDS-PAGE凝膠電泳分析(圖2D)也顯示，CAP-HS-BSA的電泳條帶滯后于蛋白標準品BSA，說明全抗原CAP-HS-BSA合成成功。3．2QBs熒光探針制備條件的優(yōu)化本研究通過將適量的QBs熒光探針溶液滴加在試紙條的結(jié)合墊上(試紙條的NC膜只包被有C線)，根據(jù)C線的熒光情況選出制備QBs熒光探針的最佳條件。當pH7．5時，C線上QBs探針-二抗偶聯(lián)物的熒光強度最強，隨著pH值升高，C線熒光強度下降(見?

圖2氯霉素半抗原CAP-HS及全抗原CAP-HS-BSA鑒定。(A)CAP標準品的高效液相色譜圖;(B)CAP-HS高效液相色譜圖;(C)CAP-HS-BSA，CAP-HS以及BSA的紫外光譜圖;(D)CAP-HS-BSA與BSA的SDS-PAGE電泳圖Fig．2IdentificationofCAP-HSandCAP-HS-BSA．(A)HPLCanalysisofCAP;(B)HPLCanalysisofCAP-HS;(C)UVspectraofCAP-HS-BSA，CAP-HSandBSA;(D)SDS-PAGEelectrophoretogramofCAP-HS-BSAandBSA．HS，succinicanhydride;BSA，bovineserumalbumin;SDS-PAGE，sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis使用2倍稀釋的QBs探針組裝的試紙條(噴涂量2μL/cm)檢測含有CAP的樣品時，獲得的T/C值明顯高于3倍稀釋的QBs探針，因此本研究最終選擇2倍稀釋的QBs探針包被試紙條的結(jié)合墊(見圖4C)。免疫層析試紙條的顯色是抗原抗體免疫學動態(tài)反應(yīng)過程，為了優(yōu)化反應(yīng)時間，本研究考察了試紙條檢測1μg/LCAP濃度時T/C值隨時間的變化，加入待測樣品后，通過成像系統(tǒng)每隔5min記錄試紙條T線和C線熒光強度(圖4D，插圖為不同免疫反應(yīng)時間下的S/N值)。結(jié)果表明，在30min內(nèi)，空白對照組和陽性組的T/C值變化不明顯，在15min時，S/N值(相同時間點下對照組和陽性組的T/C值的比值)達到最大，隨著時間延長，S/N值逐漸降低，，NC膜上的非特異性結(jié)合增強使背景顏色加深，故選擇15min為試紙條的最佳分析時間。3．3．2T線抗原及C線二抗噴涂濃度的優(yōu)化由表1可知，固定C線噴涂的二抗含量，試紙條T線的熒光強度隨T線上抗原的濃度增加而加強，T/C值也隨著抗原濃度的加大而增加;當固定T線上抗原的量為0．6mg/mL時，試紙條C線的熒光強度隨著二抗?jié)舛鹊募哟蠖鰪姟５?、5和8、9組中，雖然T線和C線的熒光強度隨著抗原或二抗的濃度增加而增加，但抑制率偏低;第6組中，包被的二抗?jié)舛葹?．2mg/mL時，?

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