【摘要】：蛋白質(zhì)是維持人體生命活動(dòng)的重要物質(zhì),具有正確的空間構(gòu)象是其發(fā)揮正常生理功能的先決條件。蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)一旦被改變,就可能導(dǎo)致生物活性改變,甚至引發(fā)疾病。迄今為止,二十多種人類(lèi)疾病被發(fā)現(xiàn)與蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的錯(cuò)誤折疊有關(guān),如p淀粉樣肽因錯(cuò)誤折疊導(dǎo)致的纖維化是阿爾茲海默氏疾病的重要特征；α-核蛋白的淀粉樣沉積與帕金森疾病有關(guān)等等,這些疾病的共同特征之一就是與之相關(guān)的蛋白質(zhì)在一定條件下發(fā)生了淀粉樣纖維化。研究表明,蛋白質(zhì)纖維化主要經(jīng)歷三個(gè)過(guò)程,即滯后期→生長(zhǎng)期→成熟期。但也有少數(shù)蛋白的纖維化過(guò)程不依賴于“核”,即無(wú)滯后期。蛋白質(zhì)在纖維化過(guò)程中,其高級(jí)結(jié)構(gòu)α-螺旋結(jié)構(gòu)減少,β-折疊結(jié)構(gòu)增加,分子內(nèi)部疏水基團(tuán)逐漸外露,這些性質(zhì)與淀粉樣纖維的物理化學(xué)性質(zhì)及其細(xì)胞毒性密切相關(guān)。尋找淀粉樣沉積相關(guān)疾病治療藥物的主要策略之一就是篩選那些能夠抑制多肽淀粉樣纖維化并破壞纖維結(jié)構(gòu)的小分子化合物。不同化合物的抗纖維化作用可能經(jīng)歷不同的分子機(jī)制,作用于纖維化過(guò)程中的不同環(huán)節(jié),深入研究各類(lèi)小分子化合物的抗多肽淀粉樣纖維化作用,可以為抗淀粉樣變性疾病提供新的有效先導(dǎo)藥物結(jié)構(gòu)。本文選取牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)作為實(shí)驗(yàn)研究的模型蛋白質(zhì),探究其在不同條件下的纖維化過(guò)程,以及表面活性劑十二烷基磺酸鈉(Sodium dodecyl sulfonate, SDS)在不同條件下對(duì)蛋白質(zhì)纖維化的抑制作用和作用機(jī)理。研究的主要內(nèi)容包括：BSA在不同pH條件下纖維化過(guò)程,SDS和SDS類(lèi)似物對(duì)BSA纖維化過(guò)程的影響,并通過(guò)內(nèi)源熒光、電泳等實(shí)驗(yàn)手段探究這些小分子化合物與BSA作用的分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法及實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1.BSA的淀粉樣纖維化采用硫磺素T (Thioflavine T, ThT)、8-苯胺基-1-萘磺酸(1-anilino-naphthalene-8-sulfonate,ANS)熒光標(biāo)記技術(shù)、圓二色譜(CD)檢測(cè)的BSA纖維化過(guò)程中結(jié)構(gòu)的變化,透射電子顯微鏡(TEM)及電泳技術(shù)觀察纖維化過(guò)程中的形態(tài)改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,BSA在pH 7.4和pH 3.0環(huán)境下均能夠形成淀粉樣纖維,纖維化過(guò)程伴隨p-折疊結(jié)構(gòu)增加,α-螺旋結(jié)構(gòu)減少,表面疏水性減弱,沒(méi)有成核期。形成的BSA纖維呈現(xiàn)密集、交叉的形態(tài),與通常的無(wú)分支結(jié)構(gòu)的淀粉樣纖維有所不同。電泳分析表明這些纖維聚集體具有共價(jià)和非共價(jià)結(jié)合兩種方式。比較而言,在pH3.0環(huán)境下纖維達(dá)到成熟期所需的時(shí)間較長(zhǎng),內(nèi)源熒光分析結(jié)果表明可能與低pH環(huán)境下蛋白質(zhì)包裹更加緊密有關(guān)。2.SDS對(duì)BSA纖維化過(guò)程的影響SDS在pH 7.4和pH 3.0環(huán)境下均能抑制BSA的纖維化,且在一定濃度范圍內(nèi),SDS的濃度與其抑制作用成正比。不同的是相同濃度的SDS在不同環(huán)境下表現(xiàn)出來(lái)的抑制作用不同,即pH 3.0時(shí)相對(duì)較弱。通過(guò)測(cè)定SDS在不同環(huán)境下對(duì)BSA內(nèi)源熒光的作用,計(jì)算SDS與BSA的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù),證實(shí)SDS在pH 7.4環(huán)境與BSA具有更高的結(jié)合常數(shù),結(jié)合比例為1：1。3.SDS類(lèi)似物對(duì)BSA纖維化的抑制作用SDS是一種陰離子表面活性劑,一端為親水的磺酸鈉,另一端為疏水的直鏈烷烴.SDS可能通過(guò)疏水或者靜電作用抑制BSA的纖維化。為此本文選取了幾種與SDS結(jié)構(gòu)類(lèi)似的物質(zhì)(己烷基磺酸鈉、辛烷基磺酸鈉、癸烷基磺酸鈉、十四烷基磺酸鈉、十六烷基磺酸鈉、十二酸鈉),通過(guò)這些化合物的作用探索這類(lèi)物質(zhì)抑制BSA纖維化的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在pH 7.4環(huán)境下,SDS主要通過(guò)疏水作用力與BSA作用,進(jìn)而抑制纖維化,當(dāng)疏水鏈的C原子數(shù)目小于10時(shí),相同濃度的物質(zhì)對(duì)BSA纖維化的抑制作用與其C原子數(shù)目成正比；當(dāng)C原子數(shù)目等于或大于10時(shí),相同濃度的物質(zhì)對(duì)BSA纖維化的抑制作用基本相同。在pH 3.0環(huán)境下,十二酸鈉可促進(jìn)BSA的纖維化,可能的原因是羧基在酸性條件下主要以羧酸分子形式存在,此時(shí)羧基上的氫與周?chē)馁|(zhì)子受體發(fā)生作用,從而促進(jìn)蛋白質(zhì)構(gòu)象向易于纖維化的構(gòu)象轉(zhuǎn)變。結(jié)論：BSA在中性(pH 7.4)和弱酸性(pH 3.0)的環(huán)境下均能夠形成淀粉樣纖維。纖維生長(zhǎng)不依賴于成核過(guò)程,同時(shí)伴隨分子中α-螺旋結(jié)構(gòu)減少、β-折疊結(jié)構(gòu)增多、表面疏水性減弱等性質(zhì)改變,最終形成的纖維呈現(xiàn)密集、具有分支結(jié)構(gòu)的形態(tài)。比較而言,BSA在pH 3.0環(huán)境下纖維化的速率較小。陰離子表面活性劑SDS能夠抑制BSA的纖維化,但相同濃度的SDS在不同pH環(huán)境下抑制作用不同。pH 7.4環(huán)境下SDS通過(guò)疏水作用與BSA結(jié)合抑制其纖維化,而在pH 3.0的環(huán)境下SDS與BSA間的結(jié)合力降低,導(dǎo)致抑制纖維化的作用減小。
【圖文】：

Ｐａｔｔｅｒｎ邋２逡逑圖１－１邋ａ－螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為ｐ？折疊結(jié)構(gòu)的兩種模型圖逡逑Ｆｉｇ邋１－１邋Ｔｗｏ邋ｍｏｄｅｌ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ａ－邋ｈｅｌｉｘ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ邋ｐ－邋ｓｈｅｅｔ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ逡逑通過(guò)上圖可知：ａ－螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為（３－折疊結(jié)構(gòu)存在兩種可能的模型。第一種逡逑型是大量的表面活性劑作用于多化鏈中的某些鏈，隨著表面活性劑分子的濃度逡逑大，作用的多化鏈數(shù)目越多；第二種模型是大量的表面活性劑平均作用于每條逡逑化鏈，隨著表面活性劑分子的濃度增大，，作用于每條多r懶吹男》腫郵科驕義隙�。辶x洗送�，还有疏水基椭Z謀┞凍潭仍嚼叢醬蠹熬奐宓牟�，租傉芯晞x豢扇苠義舷宋Ｉ傻南宋展烊舊笤諂庀暈⒕迪鹿鄄歟崢吹醬腫車(chē)南宋義锨頁(yè)氏制還躺壕齛惡姿嶧虼姿嶂崛舊蟮某墑煜宋諭干淶繾酉宋靛義瞎鄄歟煽吹較宋泳傅慕峁�，纤维的形态呈蠄�(zhí)腫場(chǎng)⒚薌⑽薹種У膩義狹�，窍佮互缠绕交织。除此之外，臍ぐ能箵]糜諮芯康鞍字實(shí)矸堊宋募煎義顯嚼叢蕉啵熱繚捕準(zhǔn)際�、高效液相ｔｖ棦謩�(shì)祝簦鰲⒑舜牛蓿罰蕕取８嚳椒ǖ膩義仙駁於蘇庖謊芯吭諶死囁蒲Ъ吧飛系鬧匾匚�。辶x

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