【摘要】：采用超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS/MS),建立了能精確檢測(cè)紅色糖多孢菌胞內(nèi)代謝物~(13)C同位素豐度的方法。在優(yōu)化的超高效液相色譜的條件及三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜的離子傳輸電壓和碰撞池電壓下,篩選出各胞內(nèi)代謝物的最佳離子對(duì)。根據(jù)物質(zhì)在LC-MS/MS中生成的母離子和子離子碳鏈長(zhǎng)短及子離子是否含有~(13)C等特性,建立了"一對(duì)一"法、"一對(duì)多"法和單級(jí)質(zhì)譜SIM法等同位素豐度檢測(cè)方法。利用這些方法,檢測(cè)了自然標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品和~(13)C標(biāo)記實(shí)驗(yàn)樣品,根據(jù)實(shí)驗(yàn)值與理論值的接近程度篩選出最優(yōu)方法。結(jié)果表明,對(duì)于以磷酸糖類為代表的子離子不含有~(13)C的代謝物,"一對(duì)一"法最有效;對(duì)于以有機(jī)酸類為代表的母離子和子離子都含有~(13)C的短碳鏈代謝物,"一對(duì)多"法更有優(yōu)勢(shì);對(duì)于以輔酶A類為代表的母離子和子離子都含有~(13)C且碳鏈較長(zhǎng)的代謝物,單級(jí)質(zhì)譜SIM法才能發(fā)揮作用。建立的同位素豐度檢測(cè)方法具有較好的準(zhǔn)確度,可應(yīng)用于紅色糖多孢菌胞內(nèi)代謝物同位素豐度的檢測(cè),為后續(xù)研究菌體的代謝機(jī)理,實(shí)現(xiàn)紅霉素的高效表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖1“一對(duì)一”法的原理。黑色圓代表碳原子帶13C標(biāo)記，白色圓代表碳原子不帶13C標(biāo)記Fig．1Principleofone-to-onemethod．Blackcirclesmeancarbonatomswith13Clabel，whitecirclesmeancar-bonatomswithout13Clabel2．5．2“一對(duì)多”法“一對(duì)多”法的原理如圖2，同樣以帶4個(gè)碳原子的母離子碰撞形成帶2個(gè)碳原子的子離子為例，當(dāng)母離子為M+2時(shí)，子離子可能是m+0、m+1、m+2，子離子的設(shè)定值為三者的中間值，降低Q3的分辨率，也就是增大Q3檢測(cè)的半高峰寬(FWHM)，擴(kuò)大了Q3的檢測(cè)范圍，將3種情況一次性檢測(cè)出來(lái)。檢測(cè)帶4個(gè)碳原子的母離子需要的離子對(duì)有5個(gè)，等于母離子碳原子數(shù)加1，較“一對(duì)一”法有大幅度的減少�！耙粚�(duì)多”法的設(shè)置如附錄2，掃描模式為SＲM，負(fù)離子模式。由于MAL的母離子與子離子所含的碳原子數(shù)一樣，故母離子與子離子所帶的標(biāo)記信息一致，MAL不存在“一對(duì)多”法。2．5．3單級(jí)質(zhì)譜SIM方法單級(jí)質(zhì)譜SIM方法的設(shè)置如附錄3，F(xiàn)WHM設(shè)為0．3amu。2．6同位素豐度檢測(cè)方法的驗(yàn)證用Isopro軟件來(lái)計(jì)算胞內(nèi)代謝物自然標(biāo)記同位素豐度理論值，然后用建好的方法，進(jìn)樣標(biāo)準(zhǔn)品，得到實(shí)測(cè)值，將理論值與實(shí)測(cè)值對(duì)比，差距用殘差平方和(SSＲ)表示。在進(jìn)行標(biāo)記實(shí)驗(yàn)時(shí)，底物中標(biāo)記的葡萄糖經(jīng)過(guò)菌體代謝，會(huì)將13C轉(zhuǎn)移到胞內(nèi)代謝物的碳骨架上，圖2“一對(duì)多”法的原理，黑色圓代表碳原子帶13C標(biāo)記，白色圓代表碳原子不帶13C標(biāo)記。Fig．2Principleofmany-to-onemethod．Blackcirclesmeancarbonatomswith13Clabel，whitecirclesmeancarbonatomswithout13Clabel．當(dāng)同位素穩(wěn)態(tài)時(shí)，胞內(nèi)代謝物的FL值固定，將理論的FL值與實(shí)測(cè)的FL值對(duì)比，對(duì)方法進(jìn)行評(píng)估。FL=∑ni=0i·Min·∑ni=0Mi

圖1“一對(duì)一”法的原理。黑色圓代表碳原子帶13C標(biāo)記，白色圓代表碳原子不帶13C標(biāo)記Fig．1Principleofone-to-onemethod．Blackcirclesmeancarbonatomswith13Clabel，whitecirclesmeancar-bonatomswithout13Clabel2．5．2“一對(duì)多”法“一對(duì)多”法的原理如圖2，同樣以帶4個(gè)碳原子的母離子碰撞形成帶2個(gè)碳原子的子離子為例，當(dāng)母離子為M+2時(shí)，子離子可能是m+0、m+1、m+2，子離子的設(shè)定值為三者的中間值，降低Q3的分辨率，也就是增大Q3檢測(cè)的半高峰寬(FWHM)，擴(kuò)大了Q3的檢測(cè)范圍，將3種情況一次性檢測(cè)出來(lái)。檢測(cè)帶4個(gè)碳原子的母離子需要的離子對(duì)有5個(gè)，等于母離子碳原子數(shù)加1，較“一對(duì)一”法有大幅度的減少�！耙粚�(duì)多”法的設(shè)置如附錄2，掃描模式為SＲM，負(fù)離子模式。由于MAL的母離子與子離子所含的碳原子數(shù)一樣，故母離子與子離子所帶的標(biāo)記信息一致，MAL不存在“一對(duì)多”法。2．5．3單級(jí)質(zhì)譜SIM方法單級(jí)質(zhì)譜SIM方法的設(shè)置如附錄3，F(xiàn)WHM設(shè)為0．3amu。2．6同位素豐度檢測(cè)方法的驗(yàn)證用Isopro軟件來(lái)計(jì)算胞內(nèi)代謝物自然標(biāo)記同位素豐度理論值，然后用建好的方法，進(jìn)樣標(biāo)準(zhǔn)品，得到實(shí)測(cè)值，將理論值與實(shí)測(cè)值對(duì)比，差距用殘差平方和(SSＲ)表示。在進(jìn)行標(biāo)記實(shí)驗(yàn)時(shí)，，底物中標(biāo)記的葡萄糖經(jīng)過(guò)菌體代謝，會(huì)將13C轉(zhuǎn)移到胞內(nèi)代謝物的碳骨架上，圖2“一對(duì)多”法的原理，黑色圓代表碳原子帶13C標(biāo)記，白色圓代表碳原子不帶13C標(biāo)記。Fig．2Principleofmany-to-onemethod．Blackcirclesmeancarbonatomswith13Clabel，whitecirclesmeancarbonatomswithout13Clabel．當(dāng)同位素穩(wěn)態(tài)時(shí)，胞內(nèi)代謝物的FL值固定，將理論的FL值與實(shí)測(cè)的FL值對(duì)比，對(duì)方法進(jìn)行評(píng)估。FL=∑ni=0i·Min·∑ni=0Mi
【作者單位】： 華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金(No.21276081) 國(guó)家科技支撐項(xiàng)目(No.2011BAF02B05)資助~~
【分類號(hào)】：O657.63;TQ927

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本文編號(hào)：2543512