【摘要】：采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)準內(nèi)標法準確測定重組人血小板生成素(rhTPO)仿制藥和原研藥中4類糖修飾的相對含量,并進行樣本間和批間一致性比較。結(jié)合多種切糖酶逐步切除rhTPO的N-糖、唾液酸和O-糖;以牛血清白蛋白(BSA)為標準品,與樣本非混合點靶;采用MALDI-TOF質(zhì)譜準內(nèi)標法檢測,分別獲得各樣本完整含糖分子量及不同層次切糖后分子量;通過分子量差值計算4類糖修飾的相對含量;最后比較仿制藥與原研藥樣本間和批間一致性。以BSA多電荷峰對rhTPO切糖前后的MALDI-TOF質(zhì)譜測定值進行準內(nèi)標法校正,BSA多電荷峰之間相對標準偏差(RSD)均≤0.075%,批間RSD為0.001%~0.004%,方法誤差均0.01%。rhTPO仿制藥N-糖、O-糖唾液酸、O-糖和糖化糖的相對含量分別約為24.6%、2.9%、9.0%和5.1%,批間一致性良好,且總糖含量與文獻值一致;rhTPO原研藥N-糖、O-糖唾液酸、O-糖和糖化糖的相對含量分別約為25.6%、2.9%、7.9%和3.5%,總糖含量較文獻值偏低。與rhTPO原研藥相比,仿制藥糖基化糖相對含量基本一致,糖化糖含量有差異。rhTPO糖化糖研究未見文獻報道,其差異是不同廠家rhTPO之間差異的重要因素,主要由發(fā)酵工藝差異導(dǎo)致。
【圖文】：

1460分析測試學(xué)報第36卷圖1MALDI－TOF質(zhì)譜內(nèi)標法(上)和準內(nèi)標法(下)示意圖Fig.1Schematicdiagramofinternal(top)andquasi-internal(bottom)calibrationofMALDI－TOFMSa，b:correctionvalue;c:correctedvalue1實驗部分1.1材料與儀器rhTPO仿制藥(批號:A1，A2，A3)為國內(nèi)藥企生產(chǎn);rhTPO原研藥(批號:B)為特比澳制劑(國產(chǎn))抽提物，由rhTPO仿制藥公司提供。N-糖切除酶PNGase－F、唾液酸切除酶Neuraminidase均購自Sigma公司;O-糖切除酶(O-Glycosidase)購自NEB公司;牛血清白蛋白(BSA)購自Ｒoche公司;α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)購自Fluka公司。4800型MALDITOF/TOF質(zhì)譜購自AB公司。1.2儀器參數(shù)MALDI－TOF質(zhì)譜線型正離子檢測模式檢測，加速電壓為18.2kV;離子源電壓為20kV;N2激光器，波長337nm，能量6000;延遲提取時間(PIE)480ns，質(zhì)譜信號單次掃描累加2000次，，質(zhì)量掃描范圍m/z5000～80000。數(shù)據(jù)分析軟件為DE4.5(ABSciex)。1.3實驗方法取rhTPO仿制藥和原研藥各150μg(1mg/mL，約150μL)，加入8mol/L尿素至尿素終濃度為6mol/L，4℃變性30min后超濾去除尿素，以50mmol/L碳酸氫銨置換溶劑，按酶與蛋白的質(zhì)量比為1∶25加入N-糖切除酶，渦旋混勻后37℃孵育16h切除N-糖，取20μL于－20℃保存?zhèn)溆?剩余樣本以50mmol/L磷酸鈉溶液(pH6.0)超濾置換溶劑，按酶與蛋白的質(zhì)量比為1∶100加入唾液酸切除酶，渦旋混勻后37℃孵育12h去除唾液酸，取20μL置于－20℃保存?zhèn)溆?剩余樣品以50mmol/L磷酸鈉溶液(pH7.5)超濾置換溶劑，按酶體積與蛋白質(zhì)量的比例為1∶10加入O-糖切除酶，渦旋混勻后37℃孵育6h切除O-糖，樣本于－20℃保存?zhèn)溆�。各取未切糖、切N-糖、切O-糖唾液酸、切O-糖的各樣本和BSA標準品適量，分別與基質(zhì)(CHCA)按適當比例混勻，按準內(nèi)標法點靶，用MALDI－TOF質(zhì)?

本首先進行MALDI－TOF質(zhì)譜檢測獲得完整含糖分子量，以BSA多電荷峰(單電荷、二電荷及三電荷)進行準內(nèi)標法校正，以A1為例，其校正質(zhì)譜圖見圖2，準內(nèi)標法校正結(jié)果見表1。BSA多電荷峰之間相對標準偏差(ＲSD)≤0.019%，批間ＲSD為0.002%，與序列分子量的誤差(即方法誤差)小于0.006%。準內(nèi)標法校正后測得仿制藥(A1、A2、A3)的完整含糖分子量在57550～57930Da之間，3批間的ＲSD為0.37%，批間一致性良好(表2)。與文獻［4］的完整含糖分子量(57539Da)相比，rhTPO仿制藥與文獻值基本一致，rhTPO原研藥含糖分子量(56302.6Da)則明顯偏低。圖2rhTPO完整分子的MALDI－TOF質(zhì)譜圖Fig.2MALDI－TOFMSofintactrhTPOA:rhTPO(A1)afterBSAinternalcalibration;B:rhTPO(A1)afterBSAquasi-internalcalibration表1rhTPO切糖前后樣本BSA準內(nèi)標法的校正結(jié)果比較Table1ComparisonofBSAquasi-internalcalibrationresultsofrhTPObeforeandafterglycanremovedBatchIntactglycoproteinN-GlycanremovedSialicacidoftheO-glycanremovedO-GlycanremovedAvg.M.W．(Da)ＲSD(%)Error(%)Avg.M.W．(Da)ＲSD(%)Error(%)Avg.M.W．(Da)ＲSD(%)Error(%)Avg.M.W．(Da)ＲSD(%)Error(%)A166432.210.0140.003366430.060.0010.000166429.180.0220.001266431.340.0110.002A266430.790.0060.001266430.040.0040.000166428.900.0210.001766428.570.0090.002A366431.350.0030.000566429.940.0010.000166429.050.0400.001466436.190.0480.009B66433.890.0190.005866431.920.0750.002966426.200.0510.005766427.900.0190.003Avg.(Da)66432.0666430.4966428.3366429.97ＲSD(%)0.0020.0010.0020.004*Avg.andＲSDwereusedtoevaluatetheconsistencyof3batchesbios
【作者單位】： 安徽醫(yī)科大學(xué)研究生院;軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所;蛋白質(zhì)藥物國家工程研究中心蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點實驗室北京正旦國際科技有限責(zé)任公司;
【基金】：國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃863項目(2014AA020906) 國家科技部重大儀器專項(2012YQ18011710) 蛋白質(zhì)組學(xué)國家重點實驗室課題(SKLP-O201412)
【分類號】：O657.63;R927.2

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本文編號：2543693