【摘要】：活性氧在自然界和生物體中普遍存在,是導(dǎo)致生命體產(chǎn)生疾病、衰老的隱形殺手。為了更好地理解活性氧在生理病理過程中的作用,對活性氧的選擇性測定尤為重要。其中,過氧亞硝酸鹽是較自由基壽命更長的活性氧物質(zhì),但是在生理條件下,其壽命也僅為10 ms。此外,活性氧物質(zhì)之間還會發(fā)生級聯(lián)反應(yīng),化學行為復(fù)雜。因此,生物體系中活性氧的選擇性測定比較困難。目前,發(fā)展最為迅速的是熒光分析法,主要是基于熒光團發(fā)生氧化反應(yīng)后熒光信號的變化來進行測定。當活性氧的氧化性差別不大時,很難實現(xiàn)對某一種活性氧的選擇性識別和反應(yīng)。與熒光分析法相比,化學發(fā)光分析法最顯著的優(yōu)勢是無需激發(fā)光源,從而能夠有效避免背景干擾。本論文基于過氧亞硝酸鹽體系的化學發(fā)光行為,開發(fā)了新型過氧亞硝酸鹽納米發(fā)光探針,包括蒙脫土納米片、半導(dǎo)體量子點和碳點。本論文使用靜態(tài)注射化學發(fā)光分析方法,實現(xiàn)了活細胞內(nèi)過氧亞硝酸鹽的高選擇性、高靈敏測定。此外,設(shè)計合成了對活性氧高穩(wěn)定的熒光金量子點,有望解決納米發(fā)光探針易被活性氧氧化導(dǎo)致發(fā)光猝滅、靈敏度降低的問題,對構(gòu)建專一性活性氧發(fā)光探針具有指導(dǎo)意義。論文主要研究內(nèi)容如下:(1)開發(fā)了一種新型的納米催化劑—蒙脫土納米片,用于增敏過氧亞硝酸鹽的超微弱化學發(fā)光。將蒙脫土納米顆粒分散在水介質(zhì)中,通過攪拌獲得蒙脫土納米片,考察了其對過氧亞硝酸鹽體系化學發(fā)光的影響。研究表明,蒙脫土納米片能夠顯著增強過氧亞硝酸鹽體系的化學發(fā)光。采用透射電子顯微鏡、原子力顯微鏡等測試方法對蒙脫土納米片的形貌進行了表征,并通過活性氧捕獲劑、電子自旋共振、化學發(fā)光光譜對反應(yīng)中間體和發(fā)光體進行確認,推測了蒙脫土納米片增敏化學發(fā)光的機理。在堿性條件下,蒙脫土納米片結(jié)構(gòu)中的鐵物種能夠催化過氧化氫分解,產(chǎn)生羥基自由基,進而與過氧亞硝酸鹽反應(yīng)生成單線態(tài)氧,當其回到三線態(tài)時產(chǎn)生較強的化學發(fā)光。(2)基于活性氧誘導(dǎo)半導(dǎo)體量子點的直接化學發(fā)光行為,構(gòu)建了一種選擇性測定過氧亞硝酸鹽的化學發(fā)光探針。由于過氧亞硝酸鹽在生理條件下能夠分解同時產(chǎn)生氧化性自由基羥基自由基和還原性自由基超氧陰離子自由基,羥基自由基能夠具有向量子點注入空穴的能力,超氧陰離子則具有向量子點注入電子的能力,最終通過電子轉(zhuǎn)移湮滅的機制產(chǎn)生化學發(fā)光。在一系列活性氧中,該探針對過氧亞硝酸鹽顯示出很好的選擇性。采用該探針測定過氧亞硝酸鹽,線性范圍為0.46～46μM,檢出限為0.11μM (S/N=3)。通過測定活細胞中的外源性過氧亞硝酸鹽,對該探針的實用性進行考察,其測定結(jié)果與理論值基本一致。(3)基于碳點表面態(tài)發(fā)光機制,構(gòu)建了一種高靈敏度的過氧亞硝酸鹽化學發(fā)光探針。采用微波法,通過改變合成前體檸檬酸和尿素的比例,對碳點的表面態(tài)發(fā)光進行了調(diào)控。通過傅里葉變換紅外光譜和X-射線光電子能譜對碳點的表面官能團進行表征。研究表明,碳點的表面態(tài)發(fā)光主要來源于表面的C-O基團。隨著C-O含量增加,碳點對過氧亞硝酸鹽的化學發(fā)光響應(yīng)逐漸增強。通過循環(huán)伏安測試對碳點的能級進行評估,探討了碳點對過氧亞硝酸鹽的響應(yīng)機理。利用該探針測定過氧亞硝酸鹽的線性范圍為0.01～3.0 μM,檢出限為5.0 nM (S/N=3)。該探針表現(xiàn)出很好的生物相容性和低毒性,被成功應(yīng)用于測定活細胞中外源性和內(nèi)源性過氧亞硝酸鹽。使用該化學發(fā)光探針測定活細胞內(nèi)的過氧亞硝酸鹽操作簡單、選擇性好、靈敏度高。(4)通過改變表面配體的結(jié)構(gòu),設(shè)計合成了一種穩(wěn)定的紅色熒光金量子點,并作為熒光標記物用于高活性氧和長時間細胞標記成像。將牛血清蛋白為配體的藍色熒光金量子點與二氫硫辛酸為配體的紅色熒光金量子點通過碳二亞胺偶聯(lián)法結(jié)合在一起,形成新的金量子點。一方面,通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移,使得金量子點的紅色熒光增強。另一方面,牛血清蛋白與二氫硫辛酸的共價連接有效地減少了牛血清蛋白分子中的螺旋結(jié)構(gòu),在金核表面形成穩(wěn)定的保護層,使得金量子點的耐氧化性和耐酶解能力明顯提高。該策略可用于調(diào)控金量子點的耐氧化性,以構(gòu)建穩(wěn)定的專一性活性氧發(fā)光探針。
[Abstract]:Active oxygen is common in nature and living organisms. It is a stealth killer that causes diseases and senescence in life bodies. In order to better understand the role of active oxygen in physiological and pathological processes, selective determination of reactive oxygen species is particularly important. In addition, its life is only 10 ms. in addition, and the reactive oxygen species may also be cascaded and the chemical behavior is complex. Therefore, the selective determination of active oxygen in the biological system is difficult. At present, the most rapid development is the fluorescence analysis method, mainly based on the change of fluorescence signal after the fluorophore oxidation reaction. It is difficult to recognize and react to a certain kind of reactive oxygen species when the oxidation of active oxygen is small. Compared with the fluorescence analysis method, the most significant advantage of the chemiluminescence analysis method is that the light source is not needed, thus the background interference can be avoided effectively. Based on the Chemiluminescence Behavior of the peroxisate system, a new type of chemical luminescence is developed. In this paper, the high selectivity and high sensitive determination of peroxy nitrite in living cells is achieved by static injection chemiluminescence analysis. In addition, a high stable fluorescent gold quantum dot for active oxygen is designed and synthesized, which is expected to solve the nano hair. The optical probe is easily destroyed by reactive oxygen oxidation and leads to the quenching of luminescence. The problem of sensitivity reduction is of guiding significance to the construction of a specific reactive oxygen luminescence probe. The main contents of this paper are as follows: (1) a new nano catalyst, montmorillonite, was developed to sensitize the ultra weak chemiluminescence of nitrite. The effect of Montmorillonite Nanoparticles on the chemiluminescence of peroxy nitrite system was investigated by mixing rice particles in water medium. The results showed that the montmorillonite nanoplates could significantly enhance the chemiluminescence of the peroxy nitrite system. The montmorillonite nanostructures were tested by transmission electron microscopy and atomic force microscopy. The morphology of the tablets was characterized, and the reaction intermediates and luminescent bodies were confirmed by the active oxygen capture agent, electron spin resonance and chemiluminescence spectrum. The mechanism of sensitizing chemiluminescence of montmorillonite nanoscale was speculated. Under alkaline conditions, the iron species in the montmorillonite nanostructure can catalyze the decomposition of hydrogen peroxide and produce hydroxyl free radicals. Based on the reaction of the peroxy nitrite to produce a single state oxygen, a strong chemiluminescence is produced when it returns to the three line state. (2) a chemiluminescence probe for selective determination of peroxy nitrite is constructed based on the Direct Chemiluminescence Behavior of the semiconductor quantum dots induced by reactive oxygen species. The solution produces both the oxidation free radical hydroxyl radical and the reductive free radical superoxide anion radical. The hydroxyl radical can have the ability to inject holes into the quantum dots, and the superoxide anion has the ability to inject electrons into the quantum dots. Finally, the chemiluminescence is produced by the electron transfer annihilation mechanism. In a series of reactive oxygen species, the superoxide anion can produce chemiluminescence. The probe is good selectivity for peroxy nitrite. The determination of peroxy nitrite with this probe is 0.46 ~ 46 mu M and the detection limit is 0.11 mu M (S/N=3). The practicability of the probe is examined by measuring the exogenous peroxy nitrite in living cells. The results are in agreement with the theoretical value. (3) based on the carbon point. A highly sensitive peroxy nitrite chemiluminescence probe was constructed by the surface state luminescence mechanism. The surface state luminescence of the carbon point was regulated by changing the proportion of citric acid and urea by microwave method. The surface functionalities of the carbon point were characterized by Fu Liye transform infrared spectroscopy and X- ray photoelectron spectroscopy. The study shows that the surface state luminescence of the carbon point is mainly derived from the C-O group on the surface. With the increase of C-O content, the chemiluminescence response of the peroxisome is gradually enhanced. The response mechanism of the carbon point to the peroxy nitrite is evaluated by cyclic voltammetry, and the peroxy nitrite is determined by the probe. The linear range of salt is 0.01 ~ 3 M and the detection limit is 5 nM (S/N=3). The probe shows good biocompatibility and low toxicity. It has been successfully applied to the determination of exogenous and endogenous peroxises in living cells. The use of the chemiluminescence probe for the determination of peroxy nitrite in living cells is simple, selective and highly sensitive. (4) a stable red fluorescent quantum dot was designed and synthesized by changing the structure of the surface ligand, and used as a fluorescent marker for high active oxygen and long time cell labeling imaging. The blue fluorescent gold quantum dots with the ligand of bovine serum protein were coupled with the red fluorescent quantum dot of the two hydrogen sulfide octanoic acid as the ligand of the two imide coupling. Together, the new gold quantum dots are formed. On the one hand, the red fluorescence of the gold quantum dots is enhanced by the fluorescence resonance energy transfer. On the other hand, the covalent connection between the bovine serum protein and the two hydrogen lipoic acid effectively reduces the spiral structure in the bovine serum protein molecules and forms a stable protective layer on the surface of the gold nucleus, allowing the gold quantum to be made. This strategy can be used to regulate the oxidation resistance of gold quantum dots to construct stable and specific ROS luminescent probes.
【學位授予單位】：北京化工大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：O657.3

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本文編號：2167345