【摘要】：磷光銥配合物具有發(fā)射壽命長、光穩(wěn)定性好、發(fā)射波長易調(diào)節(jié)和量子效率高等優(yōu)異的光物理性質(zhì),被廣泛應(yīng)用于化學(xué)傳感和生物成像等領(lǐng)域。共聚焦激光掃描顯微鏡和時間分辨光學(xué)顯微鏡是生命科學(xué)領(lǐng)域先進(jìn)的光學(xué)成像設(shè)備。共聚焦顯微鏡具有優(yōu)越的光學(xué)切片和三維重建能力,可在體內(nèi)和體外獲得高度清晰的圖像�；诹坠忏炁浜衔镩L的發(fā)射壽命,可通過時間分辨光學(xué)技術(shù),結(jié)合發(fā)光壽命成像和時間門成像,有效地消除生物體內(nèi)短壽命自發(fā)熒光的干擾,提高檢測信噪比。共聚焦激光掃描顯微鏡和時間分辨光學(xué)顯微鏡在活細(xì)胞成像領(lǐng)域已得到很好的發(fā)展,但在活體成像領(lǐng)域報道較少。本論文中,我們首先探究了細(xì)胞及線粒體內(nèi)極性變化,其次我們將基于銥配合物的磷光探針注射進(jìn)斑馬魚體內(nèi),實現(xiàn)斑馬魚活體層次的時間分辨光學(xué)成像。主要工作有:1、以對極性敏感的線粒體靶向磷光探針為研究對象,通過共聚焦和發(fā)光壽命成像顯微鏡發(fā)現(xiàn),相比于HL-7702正常細(xì)胞,磷光探針在HepG2癌細(xì)胞中發(fā)射光譜藍(lán)移并且發(fā)射壽命變長,表明癌細(xì)胞極性比正常細(xì)胞小,通過發(fā)射壽命不同成功區(qū)分了正常細(xì)胞與癌細(xì)胞,這在癌癥診斷方面具有良好的應(yīng)用前景;接著通過發(fā)光壽命成像顯微鏡監(jiān)測在細(xì)胞凋亡過程中線粒體極性的變化,結(jié)果表明在細(xì)胞凋亡過程中探針在線粒體中發(fā)射壽命逐漸變長,說明線粒體極性變小,并且不同細(xì)胞狀態(tài)下發(fā)射壽命不同,從而通過發(fā)光壽命成像實現(xiàn)了對活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和死細(xì)胞的區(qū)分。2、探究水溶性磷光探針的斑馬魚成像實驗,通過考察顯微注射時斑馬魚麻醉劑的濃度、注射針頭粗細(xì)、注射位置、成像時斑馬魚擺放位置以及磷光探針注射體積,一系列不同因素對顯微注射及成像結(jié)果的影響,得到了最佳注射及成像條件,為斑馬魚成像應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。3、以對溫度敏感的水溶性磷光探針為研究對象,首先利用共聚焦和發(fā)光壽命成像顯微鏡檢測探針在細(xì)胞內(nèi)對溫度的響應(yīng)性,結(jié)果表明隨著溫度升高探針發(fā)射壽命增加,基于細(xì)胞內(nèi)良好的溫度響應(yīng)性,我們將磷光探針通過顯微注射進(jìn)斑馬魚體內(nèi),在共聚焦成像結(jié)果中發(fā)現(xiàn)斑馬魚自身強(qiáng)烈的自發(fā)熒光嚴(yán)重干擾了結(jié)果的準(zhǔn)確性,因此我們利用發(fā)光壽命成像顯微鏡將長壽命的磷光探針從短壽命自發(fā)熒光中區(qū)分出來。更重要的是利用時間分辨成像技術(shù)扣除了斑馬魚自身短壽命自發(fā)熒光,提高了檢測的信噪比,這是首次利用磷光探針實現(xiàn)在斑馬魚體內(nèi)的溫度響應(yīng)。
[Abstract]:Iridium phosphorescent complexes have been widely used in chemical sensing and biological imaging for their excellent photophysical properties such as long emission lifetime, good optical stability, easy to adjust emission wavelength and high quantum efficiency. Confocal laser scanning microscope and time-resolved optical microscope are the advanced optical imaging equipment in the field of life science. Confocal microscope has excellent optical slice and three-dimensional reconstruction ability, and can obtain high-definition image in vivo and in vitro. Based on the long emission lifetime of iridium phosphorescent complexes, the interference of short-lived autofluorescence can be effectively eliminated and the signal-to-noise ratio (SNR) can be improved by time-resolved optical technology, combined with light-emitting lifetime imaging and time-gate imaging. Confocal laser scanning microscopy and time-resolved optical microscope have been well developed in the field of living cell imaging, but there are few reports in the field of in vivo imaging. In this thesis, we first investigated the changes of intracellular polarity in cells and mitochondria. Secondly, we injected phosphorescence probes based on iridium complexes into zebrafish to achieve time-resolved optical imaging at the living level of zebrafish. The main work was: 1. The polarity sensitive mitochondrial targeted phosphorescence probe was used as the research object. Confocal and luminescent lifetime imaging microscopy showed that compared with the normal HL-7702 cells, The blue shift of emission spectrum and the longer emission lifetime of the phosphorescence probe in HepG2 cancer cells indicate that the polarity of cancer cells is smaller than that of normal cells. It has a good application prospect in cancer diagnosis, and then monitor the changes of mitochondrial polarity during apoptosis by Luminescent Lifetime Imaging microscope. The results showed that the emission lifetime of the probe in mitochondria gradually became longer during apoptosis, which indicated that the polarity of mitochondria became smaller, and the emission lifetime was different in different cell states. The difference between apoptotic cells and dead cells. 2. The zebrafish imaging experiment with water-soluble phosphorescence probe was carried out. The concentration of anesthetic, the thickness of injection needle and the injection location were investigated. The position of zebrafish and the injection volume of phosphorescence probe during imaging. A series of different factors affect the microinjection and imaging results. The optimum conditions of injection and imaging are obtained. This study laid a foundation for zebrafish imaging application. The temperature sensitive water-soluble phosphorescence probe was used as the research object. Firstly, confocal and luminescent lifetime imaging microscopy was used to detect the temperature response of the probe in the cell. The results showed that the fluorescence probe was microinjected into zebrafish due to its good temperature response. In confocal imaging, it was found that the zebrafish's own strong autofluorescence seriously interfered with the accuracy of the results. Therefore, we used the luminescent lifetime imaging microscope to distinguish the long-lived phosphorescence probe from the short-lived autofluorescence. More importantly, the time-resolved imaging technique is used to deduct the short-lived autofluorescence of zebrafish and improve the signal-to-noise ratio. This is the first time to realize the temperature response in zebrafish by using phosphorescence probe.
【學(xué)位授予單位】：南京郵電大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q-33;O657.3

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本文編號：2163879