發(fā)布時(shí)間：2018-06-05 12:18

  本文選題：細(xì)胞電化學(xué) + 毒性��； 參考：《東北師范大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：水污染已成為全球最為突出的環(huán)境問(wèn)題之一。其中,多種重金屬和酚類污染物已被美國(guó)環(huán)境保護(hù)署列為優(yōu)先控制污染物,它們一般具有分布廣、毒性大等特點(diǎn),其造成的水環(huán)境污染及對(duì)生物的危害日益受到公眾關(guān)注和科研工作者重視,利用高效的生物檢測(cè)技術(shù)對(duì)其毒性進(jìn)行早期預(yù)警與評(píng)價(jià)顯得極為重要。然而,目前大部分常規(guī)體外毒性檢測(cè)方法具有操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)、有毒、費(fèi)用高等缺點(diǎn)。因此,急需建立簡(jiǎn)單、快速、無(wú)毒、成本低的毒性檢測(cè)新方法。細(xì)胞電化學(xué)是近十年發(fā)展起來(lái)的一個(gè)領(lǐng)域,它通過(guò)電化學(xué)手段對(duì)細(xì)胞的電化學(xué)行為進(jìn)行分析,進(jìn)而揭示細(xì)胞的結(jié)構(gòu) 功能關(guān)系并評(píng)價(jià)外源物質(zhì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的影響。與傳統(tǒng)體外毒性評(píng)價(jià)方法相比,細(xì)胞電化學(xué)方法具有無(wú)需標(biāo)記、無(wú)毒、簡(jiǎn)單、靈敏、快速的特點(diǎn),已成為細(xì)胞活性評(píng)價(jià)的重要研究手段。該領(lǐng)域的研究主要集中于兩方面,一是揭示細(xì)胞的電化學(xué)響應(yīng)機(jī)理;二是利用新型納米材料對(duì)電極進(jìn)行修飾以提高檢測(cè)靈敏度。機(jī)理研究方面,目前從核苷酸代謝角度得到的較為清晰的解釋是,細(xì)胞的電化學(xué)響應(yīng)來(lái)源于細(xì)胞質(zhì)中鳥(niǎo)嘌呤和黃嘌呤的氧化反應(yīng),且以混合信號(hào)的形式存在。與之相比,該領(lǐng)域關(guān)于納米材料修飾電極的研究才剛剛起步。新型納米材料的出現(xiàn),有望提高現(xiàn)有電化學(xué)信號(hào)的響應(yīng)強(qiáng)度以及產(chǎn)生新的響應(yīng)信號(hào),從而促進(jìn)細(xì)胞電化學(xué)方法的進(jìn)一步發(fā)展。綜上,本文以兩種碳納米材料(石墨烯、碳納米管)為基底材料,制備了多種具有高催化性能的修飾電極,利用掃描電子顯微鏡(SEM)、X射線光電子能譜(XPS)、X射線衍射分析(XRD)、拉曼光譜、X射線能譜(EDS)、電化學(xué)阻抗譜(EIS)、循環(huán)伏安法進(jìn)行了表征。以人宮頸癌(HeLa)細(xì)胞和人肝癌(HepG2)細(xì)胞為模型,對(duì)其電化學(xué)行為進(jìn)行了深入研究,結(jié)合高效液相色譜分析揭示了其電化學(xué)響應(yīng)機(jī)理,同時(shí)跟蹤了細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,進(jìn)而建立了基于不同納米修飾電極的細(xì)胞電化學(xué)方法。評(píng)價(jià)了多種重金屬和酚類污染物對(duì)細(xì)胞活性的影響,并與傳統(tǒng)MTT比色法進(jìn)行了比較。本文為環(huán)境污染物毒性評(píng)價(jià)和水體安全性評(píng)價(jià)提供了新的技術(shù)方法。主要研究結(jié)果如下:1.采用電化學(xué)還原法制備了石墨烯修飾玻碳電極(ERGO/GCE),避免了常規(guī)化學(xué)還原操作繁瑣、還原劑有毒、條件要求高等問(wèn)題。電極表征結(jié)果顯示,電化學(xué)還原可有效去除氧化石墨烯的部分含氧官能團(tuán),使其電子傳遞能力及電催化性能明顯提高。利用ERGO/GCE對(duì)HeLa細(xì)胞裂解液的伏安行為進(jìn)行研究,在+0.68 V位置測(cè)得一個(gè)明顯的氧化峰,結(jié)合高效液相色譜分析證實(shí)其歸因于細(xì)胞中鳥(niǎo)嘌呤和黃嘌呤的氧化反應(yīng)。利用ERGO/GCE描述了HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線,結(jié)果與傳統(tǒng)細(xì)胞計(jì)數(shù)法一致。在此基礎(chǔ)上,建立了基于ERGO/GCE的細(xì)胞電化學(xué)方法。利用該方法評(píng)價(jià)Cr6+、Cd~(2+)、Cu~(2+)、Pb~(2+)、Zn~(2+)對(duì)HeLa細(xì)胞的毒性,發(fā)現(xiàn)其存在顯著的時(shí)間效應(yīng)和劑量效應(yīng)關(guān)系,五種重金屬的毒性大小順序?yàn)镃r6+Cd~(2+)Cu~(2+)Pb~(2+)Zn~(2+),30 h半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為5.56、19.68、36.56、57.50、121.00μM。與傳統(tǒng)MTT比色法相比,基于ERGO/GCE的細(xì)胞電化學(xué)方法更為簡(jiǎn)單、快速、靈敏。2.利用刮涂法制備了碳納米管-離子液體修飾玻碳電極(MWCNTs-IL/GCE),將電化學(xué)檢測(cè)電位窗由0 +0.80 V擴(kuò)大至0 +1.10 V。通過(guò)表征發(fā)現(xiàn),IL的摻雜降低了MWCNTs的纏繞程度,有效促進(jìn)了電子轉(zhuǎn)移,MWCNTs-IL/GCE的電化學(xué)阻抗值幾乎降為零,電活性表面積顯著增大。MWCNTs-IL/GCE對(duì)HeLa細(xì)胞裂解液具有良好的電催化活性,在+0.72 V和+1.03 V處分別檢測(cè)到歸因于鳥(niǎo)嘌呤/黃嘌呤、腺嘌呤/次黃嘌呤的伏安信號(hào)。利用該電極對(duì)HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程進(jìn)行了研究,在此基礎(chǔ)上建立了基于MWCNTs-IL/GCE的雙信號(hào)細(xì)胞電化學(xué)檢測(cè)方法。評(píng)價(jià)了2,4-二氯酚(2,4-DCP)、2,4,6-三氯酚(2,4,6-TCP)、五氯酚(PCP)對(duì)HeLa細(xì)胞的毒性,根據(jù)信號(hào)Ⅰ和信號(hào)Ⅱ的細(xì)胞毒性關(guān)系曲線得到三種氯酚污染物的IC50值分別為451.76、172.51、75.92μM和495.76、198.53、96.39μM,毒性順序?yàn)镻CP2,4,6-TCP2,4-DCP,與MTT比色法所得毒性規(guī)律一致。3.通過(guò)電化學(xué)還原和電聚合方法制備了溴甲酚紫/石墨烯修飾玻碳電極(BCP/erGO/GCE),其中,電化學(xué)還原過(guò)程可以有效恢復(fù)石墨烯的π-π共軛結(jié)構(gòu),有利于其與BCP分子發(fā)生π-π堆積作用,得到的二元復(fù)合修飾電極電活性位點(diǎn)增多、電子傳遞能力增強(qiáng)。BCP/erGO/GCE同樣可以檢測(cè)到HeLa細(xì)胞裂解液的兩個(gè)明顯的伏安信號(hào),分別位于+0.62 V和+0.83 V位置。利用該電極研究了HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線,進(jìn)而建立了基于BCP/erGO/GCE的雙信號(hào)細(xì)胞電化學(xué)方法。對(duì)五種重金屬(Cr6+、Cd~(2+)、Cu~(2+)、Pb~(2+)、Zn~(2+))的毒性進(jìn)行檢測(cè),根據(jù)信號(hào)Ⅰ和信號(hào)Ⅱ得到的IC50值分別為4.53、15.45、26.36、52.20、101.86μM和7.06、21.32、35.81、67.28、119.67μM,毒性規(guī)律為Cr6+Cd~(2+)Cu~(2+)Pb~(2+)Zn~(2+)。與基于ERGO/GCE的單信號(hào)細(xì)胞電化學(xué)方法相比,該方法信號(hào)Ⅰ(鳥(niǎo)嘌呤/黃嘌呤)對(duì)重金屬的毒性響應(yīng)更為靈敏。與MWCNTs-IL/GCE相比,BCP/erGO/GCE的穩(wěn)定性更高。4.制備了具有協(xié)同效應(yīng)的聚羅丹明B/氧化石墨烯/碳納米管修飾玻碳電極(PRhB/GO/MWCNTs/GCE),有效防止了GO納米片和MWCNTs的團(tuán)聚,提高了三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的電活性表面積和催化性能。研究了HepG2細(xì)胞裂解液的電化學(xué)行為,在+0.58V和+0.91 V位置檢測(cè)到兩個(gè)不可逆的氧化峰,結(jié)合高效液相色譜分析進(jìn)一步證實(shí)其分別來(lái)源于鳥(niǎo)嘌呤/黃嘌呤、腺嘌呤/次黃嘌呤的氧化反應(yīng)。利用該電極對(duì)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行了跟蹤,在此基礎(chǔ)上建立了基于PRhB/GO/MWCNTs/GCE的雙信號(hào)細(xì)胞電化學(xué)檢測(cè)方法。研究了2,4,6-三氯酚(2,4,6-TCP)和五氯酚(PCP)對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性,根據(jù)信號(hào)Ⅰ得到的IC50值分別為201.37μM和71.09μM,根據(jù)信號(hào)Ⅱ得到的IC50值分別為217.02μM和89.74μM,毒性大小順序?yàn)镻CP2,4,6-TCP。該電極也可用于對(duì)2,4,6-TCP和PCP含量的靈敏測(cè)定,檢出限分別為0.8 nM和0.5 nM。據(jù)此,基于PRhB/GO/MWCNTs/GCE的電化學(xué)方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)氯酚類污染物的定量檢測(cè)與毒性評(píng)價(jià)。5.制備了可用于96微孔培養(yǎng)板的氧化石墨烯量子點(diǎn)/羧基化碳納米管修飾鉛芯微型電極(GOQDs/CMWCNTs/PGE),打破了常規(guī)電化學(xué)檢測(cè)只能在培養(yǎng)皿中使用的局限,將細(xì)胞用量由1 mL降低為100μL。同時(shí)該復(fù)合修飾電極具有優(yōu)異的導(dǎo)電性和催化活性,實(shí)現(xiàn)了對(duì)腺嘌呤和次黃嘌呤混合信號(hào)的分離,在+0.67 V、+0.94 V和+1.00 V位置檢測(cè)到三個(gè)分別歸屬于鳥(niǎo)嘌呤/黃嘌呤、腺嘌呤、次黃嘌呤的氧化峰。利用該電極研究了HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程,進(jìn)而建立了基于GOQDs/CMWCNTs/PGE的三信號(hào)細(xì)胞電化學(xué)方法。評(píng)價(jià)了Cd~(2+)、Hg~(2+)、Pb~(2+)、2,4-二硝基苯酚(2,4-DNP)、2,4,6-三氯酚(2,4,6-TCP)、五氯酚(PCP)六種環(huán)境優(yōu)先控制污染物對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性,基于信號(hào)I、信號(hào)II、信號(hào)III得到的IC50值分別為Cd~(2+):6.25、5.62、7.99μM;Hg~(2+):9.65、8.80、9.82μM;Pb~(2+):47.95、44.18、60.69μM;2,4-DNP:446.07、418.21、487.87μM;2,4,6-TCP:195.89、178.65、202.21μM;PCP:68.87、61.24、78.71μM,毒性順序?yàn)镃d~(2+)Hg~(2+)Pb~(2+)PCP2,4,6-TCP2,4-DNP,與傳統(tǒng)MTT比色法所得規(guī)律一致。基于GOQDs/CMWCNTs/PGE的細(xì)胞電化學(xué)方法具有成本低、靈敏度高等特點(diǎn),為細(xì)胞生理代謝過(guò)程研究及環(huán)境污染物高通量分析提供了技術(shù)平臺(tái)。
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本文編號(hào)：1981967