本文選題：細胞電化學(xué) + 毒性　； 參考：《東北師范大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：水污染已成為全球最為突出的環(huán)境問題之一。其中,多種重金屬和酚類污染物已被美國環(huán)境保護署列為優(yōu)先控制污染物,它們一般具有分布廣、毒性大等特點,其造成的水環(huán)境污染及對生物的危害日益受到公眾關(guān)注和科研工作者重視,利用高效的生物檢測技術(shù)對其毒性進行早期預(yù)警與評價顯得極為重要。然而,目前大部分常規(guī)體外毒性檢測方法具有操作復(fù)雜、費時、有毒、費用高等缺點。因此,急需建立簡單、快速、無毒、成本低的毒性檢測新方法。細胞電化學(xué)是近十年發(fā)展起來的一個領(lǐng)域,它通過電化學(xué)手段對細胞的電化學(xué)行為進行分析,進而揭示細胞的結(jié)構(gòu) 功能關(guān)系并評價外源物質(zhì)對細胞產(chǎn)生的影響。與傳統(tǒng)體外毒性評價方法相比,細胞電化學(xué)方法具有無需標(biāo)記、無毒、簡單、靈敏、快速的特點,已成為細胞活性評價的重要研究手段。該領(lǐng)域的研究主要集中于兩方面,一是揭示細胞的電化學(xué)響應(yīng)機理;二是利用新型納米材料對電極進行修飾以提高檢測靈敏度。機理研究方面,目前從核苷酸代謝角度得到的較為清晰的解釋是,細胞的電化學(xué)響應(yīng)來源于細胞質(zhì)中鳥嘌呤和黃嘌呤的氧化反應(yīng),且以混合信號的形式存在。與之相比,該領(lǐng)域關(guān)于納米材料修飾電極的研究才剛剛起步。新型納米材料的出現(xiàn),有望提高現(xiàn)有電化學(xué)信號的響應(yīng)強度以及產(chǎn)生新的響應(yīng)信號,從而促進細胞電化學(xué)方法的進一步發(fā)展。綜上,本文以兩種碳納米材料(石墨烯、碳納米管)為基底材料,制備了多種具有高催化性能的修飾電極,利用掃描電子顯微鏡(SEM)、X射線光電子能譜(XPS)、X射線衍射分析(XRD)、拉曼光譜、X射線能譜(EDS)、電化學(xué)阻抗譜(EIS)、循環(huán)伏安法進行了表征。以人宮頸癌(HeLa)細胞和人肝癌(HepG2)細胞為模型,對其電化學(xué)行為進行了深入研究,結(jié)合高效液相色譜分析揭示了其電化學(xué)響應(yīng)機理,同時跟蹤了細胞生長曲線,進而建立了基于不同納米修飾電極的細胞電化學(xué)方法。評價了多種重金屬和酚類污染物對細胞活性的影響,并與傳統(tǒng)MTT比色法進行了比較。本文為環(huán)境污染物毒性評價和水體安全性評價提供了新的技術(shù)方法。主要研究結(jié)果如下:1.采用電化學(xué)還原法制備了石墨烯修飾玻碳電極(ERGO/GCE),避免了常規(guī)化學(xué)還原操作繁瑣、還原劑有毒、條件要求高等問題。電極表征結(jié)果顯示,電化學(xué)還原可有效去除氧化石墨烯的部分含氧官能團,使其電子傳遞能力及電催化性能明顯提高。利用ERGO/GCE對HeLa細胞裂解液的伏安行為進行研究,在+0.68 V位置測得一個明顯的氧化峰,結(jié)合高效液相色譜分析證實其歸因于細胞中鳥嘌呤和黃嘌呤的氧化反應(yīng)。利用ERGO/GCE描述了HeLa細胞的生長曲線,結(jié)果與傳統(tǒng)細胞計數(shù)法一致。在此基礎(chǔ)上,建立了基于ERGO/GCE的細胞電化學(xué)方法。利用該方法評價Cr6+、Cd~(2+)、Cu~(2+)、Pb~(2+)、Zn~(2+)對HeLa細胞的毒性,發(fā)現(xiàn)其存在顯著的時間效應(yīng)和劑量效應(yīng)關(guān)系,五種重金屬的毒性大小順序為Cr6+Cd~(2+)Cu~(2+)Pb~(2+)Zn~(2+),30 h半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為5.56、19.68、36.56、57.50、121.00μM。與傳統(tǒng)MTT比色法相比,基于ERGO/GCE的細胞電化學(xué)方法更為簡單、快速、靈敏。2.利用刮涂法制備了碳納米管-離子液體修飾玻碳電極(MWCNTs-IL/GCE),將電化學(xué)檢測電位窗由0 +0.80 V擴大至0 +1.10 V。通過表征發(fā)現(xiàn),IL的摻雜降低了MWCNTs的纏繞程度,有效促進了電子轉(zhuǎn)移,MWCNTs-IL/GCE的電化學(xué)阻抗值幾乎降為零,電活性表面積顯著增大。MWCNTs-IL/GCE對HeLa細胞裂解液具有良好的電催化活性,在+0.72 V和+1.03 V處分別檢測到歸因于鳥嘌呤/黃嘌呤、腺嘌呤/次黃嘌呤的伏安信號。利用該電極對HeLa細胞的生長過程進行了研究,在此基礎(chǔ)上建立了基于MWCNTs-IL/GCE的雙信號細胞電化學(xué)檢測方法。評價了2,4-二氯酚(2,4-DCP)、2,4,6-三氯酚(2,4,6-TCP)、五氯酚(PCP)對HeLa細胞的毒性,根據(jù)信號Ⅰ和信號Ⅱ的細胞毒性關(guān)系曲線得到三種氯酚污染物的IC50值分別為451.76、172.51、75.92μM和495.76、198.53、96.39μM,毒性順序為PCP2,4,6-TCP2,4-DCP,與MTT比色法所得毒性規(guī)律一致。3.通過電化學(xué)還原和電聚合方法制備了溴甲酚紫/石墨烯修飾玻碳電極(BCP/erGO/GCE),其中,電化學(xué)還原過程可以有效恢復(fù)石墨烯的π-π共軛結(jié)構(gòu),有利于其與BCP分子發(fā)生π-π堆積作用,得到的二元復(fù)合修飾電極電活性位點增多、電子傳遞能力增強。BCP/erGO/GCE同樣可以檢測到HeLa細胞裂解液的兩個明顯的伏安信號,分別位于+0.62 V和+0.83 V位置。利用該電極研究了HeLa細胞的生長曲線,進而建立了基于BCP/erGO/GCE的雙信號細胞電化學(xué)方法。對五種重金屬(Cr6+、Cd~(2+)、Cu~(2+)、Pb~(2+)、Zn~(2+))的毒性進行檢測,根據(jù)信號Ⅰ和信號Ⅱ得到的IC50值分別為4.53、15.45、26.36、52.20、101.86μM和7.06、21.32、35.81、67.28、119.67μM,毒性規(guī)律為Cr6+Cd~(2+)Cu~(2+)Pb~(2+)Zn~(2+)。與基于ERGO/GCE的單信號細胞電化學(xué)方法相比,該方法信號Ⅰ(鳥嘌呤/黃嘌呤)對重金屬的毒性響應(yīng)更為靈敏。與MWCNTs-IL/GCE相比,BCP/erGO/GCE的穩(wěn)定性更高。4.制備了具有協(xié)同效應(yīng)的聚羅丹明B/氧化石墨烯/碳納米管修飾玻碳電極(PRhB/GO/MWCNTs/GCE),有效防止了GO納米片和MWCNTs的團聚,提高了三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的電活性表面積和催化性能。研究了HepG2細胞裂解液的電化學(xué)行為,在+0.58V和+0.91 V位置檢測到兩個不可逆的氧化峰,結(jié)合高效液相色譜分析進一步證實其分別來源于鳥嘌呤/黃嘌呤、腺嘌呤/次黃嘌呤的氧化反應(yīng)。利用該電極對HepG2細胞的生長曲線進行了跟蹤,在此基礎(chǔ)上建立了基于PRhB/GO/MWCNTs/GCE的雙信號細胞電化學(xué)檢測方法。研究了2,4,6-三氯酚(2,4,6-TCP)和五氯酚(PCP)對HepG2細胞的毒性,根據(jù)信號Ⅰ得到的IC50值分別為201.37μM和71.09μM,根據(jù)信號Ⅱ得到的IC50值分別為217.02μM和89.74μM,毒性大小順序為PCP2,4,6-TCP。該電極也可用于對2,4,6-TCP和PCP含量的靈敏測定,檢出限分別為0.8 nM和0.5 nM。據(jù)此,基于PRhB/GO/MWCNTs/GCE的電化學(xué)方法實現(xiàn)了對氯酚類污染物的定量檢測與毒性評價。5.制備了可用于96微孔培養(yǎng)板的氧化石墨烯量子點/羧基化碳納米管修飾鉛芯微型電極(GOQDs/CMWCNTs/PGE),打破了常規(guī)電化學(xué)檢測只能在培養(yǎng)皿中使用的局限,將細胞用量由1 mL降低為100μL。同時該復(fù)合修飾電極具有優(yōu)異的導(dǎo)電性和催化活性,實現(xiàn)了對腺嘌呤和次黃嘌呤混合信號的分離,在+0.67 V、+0.94 V和+1.00 V位置檢測到三個分別歸屬于鳥嘌呤/黃嘌呤、腺嘌呤、次黃嘌呤的氧化峰。利用該電極研究了HepG2細胞的生長過程,進而建立了基于GOQDs/CMWCNTs/PGE的三信號細胞電化學(xué)方法。評價了Cd~(2+)、Hg~(2+)、Pb~(2+)、2,4-二硝基苯酚(2,4-DNP)、2,4,6-三氯酚(2,4,6-TCP)、五氯酚(PCP)六種環(huán)境優(yōu)先控制污染物對HepG2細胞的毒性,基于信號I、信號II、信號III得到的IC50值分別為Cd~(2+):6.25、5.62、7.99μM;Hg~(2+):9.65、8.80、9.82μM;Pb~(2+):47.95、44.18、60.69μM;2,4-DNP:446.07、418.21、487.87μM;2,4,6-TCP:195.89、178.65、202.21μM;PCP:68.87、61.24、78.71μM,毒性順序為Cd~(2+)Hg~(2+)Pb~(2+)PCP2,4,6-TCP2,4-DNP,與傳統(tǒng)MTT比色法所得規(guī)律一致�；贕OQDs/CMWCNTs/PGE的細胞電化學(xué)方法具有成本低、靈敏度高等特點,為細胞生理代謝過程研究及環(huán)境污染物高通量分析提供了技術(shù)平臺。
[Abstract]:姘存薄鏌撳凡鎴愪負(fù)鍏ㄧ悆鏈，

本文編號：1981967